F2 Den Kromatografiska Processen (Kromatografiteori)

Front 1

Nämn tre typiska användningsområden för kromatografi

Back 1

Separation

Identifiering/detektion

Kvantifiering

Front 2

Hur fungerar (i praktiken) kromatografi som separationsmetod?

Back 2

Separationsmetod där komponenterna som ska separeras,fördelas mellan två faser, en stationär fas och en mobil fas.

Front 3

Vad är det som skiljer "provet" från den stationära fasen?

Back 3

Starka eller svaga interaktioner till den stationära fasen /mobila fasen

Front 4

Nämn några olika sorters användningsområden för kromatografi

Back 4

Från små molekyler eller joner till stora biomolekyler eller polymerer

Från enstaka ämnen till komplex blandningar av hundratals komponenter

Från bulkanalyser till spårämneshalter

Front 5

Vad finns det för olika typer av kromatografi?

Back 5

Tunnskiktskromatografi (TLC)

Kolonnkromatografi

Front 6

Hur fungerar tunnskiktskromatografi (TLC)?

Back 6

Mobilfasen är en vätska, stationär fasen är en slags fast skiva med polära funktionella grupper på. Genom att variera mobilfasens poläritet vandrar olika ämnen olika snabbt upp för "skivan"

Front 7

Nämn 3 olika sorters kolonnkromatografi

Back 7

Vätskekromatografi (LC). Mobilfasen är en vätska

Gaskromatografi (GC) Mobilfasen är en gas

Superkritiskvätskekromatografi (SFC) Mobilfasen är en superkritisk vätska (kombination mellan LC och GC), mer miljövänlig

Front 8

Hur vet man vilken slags kolonnkromatografimetod man ska använda?

Back 8

Vilken teknik man ska använda beror på vilken typ av prov man har, vad det innehåller, vad du vill ha för resultat m.m. Därför är det alltid bra att veta så mycket om sitt prov som möjligt

Front 9

Vad är en superkritisk vätska?

Back 9

En superkritisk vätska är ett ämne som befinner sig under så högt tryck och temperatur att fasgränsen mellan vätska och gas har försvunnit. När förhållandena närmar sig den kritiska punkten, blir gasfasens densitet allt närmare vätskefasens tills dessa inte längre går att skilja åt. Superkritiska vätskor har den unika förmågan att diffundera genom fast formfasta material som en gas men även lösa upp ämnen som en vätska.

Front 10

Vad står tm för?

Back 10

"dötid" innan den första toppen syns på kromatogrammet.

Front 11

Förklara bilden

Back 11

Just do it

Front 12

Vad är retentionstid, och hur kan den användas analytiskt?

Back 12

Retentionstid = "hur lång tid det tar för ett ämne att gå igenom kolonnen".

Kan användas till att räkna ut hastighet för t.ex. mobilfas (om man har tm)

Retentionstiden kan också användas vid detektion- för att se om ett ämne som borde finnas med saknar en topp t.ex.

Front 13

Hur räknar man ut retentionstiden?

Back 13

Front 14

Vad är upplösning när man pratar om kromatogram? Hur beräknar man upplösningen?

Back 14

Upplösning = helt enkelt hur bra separarerade topparna är i kromatogrammet. Bättre upplösning --> ser att toppar separeras--> fler ämnen kan urskiljas.

R = resolution = Upplösning

Front 15

Vad är en retentionsfaktor?

Vad bör den ligga på?

Back 15

k' = retentionsfaktor, kan även kallas fördelningsfaktor, kapacitetsfaktor, fördelningsförhållande, kapacitetsförhållande.

Högt k' = lång tid i stationär fas.

k' bör ligga på 2-10

Front 16

Hur räknar man ut retentionsfaktorn?

Back 16

Front 17

Hur kan man ändra retentionsfaktorn?

Back 17

Ändras genom temperatur (GC)

Typ av stationär fas (GC, LC)

Sammansättning av mobilfas (LC)

Front 18

Om retentionsfaktorn är över 15, vad bör göras?

Back 18

Höj temperaturen! Den har då för mycket tid i den stationära fasen.

Front 19

Vad är selektivitet (α) för något, när vi har att göra med kromatografi/kromatogram?

Back 19

α är kvoten av ämnenas retentionsfaktor. MÅSTE vara högre än 1.

Front 20

Vad är bra resp. sämre selektivitet? Hur kan man ändra selektiviteten?

Back 20

1= bra, 2 = sämre.

Selektiviteten kan ändras mha:

- Sammansättning och typ av mobilfas (LC)

- Kolonntemperatur (framförallt GC) (kan inte alltid ändras)

- Typ av stationärfas

- Speciella kemiska interaktioner (t.ex. kirala faser, affinitet)

(kirala faser- fångar bara upp en slags enantiomer)

Front 21

Formen på kromatogramtopparna påverkas av...?

Back 21

Effektiviteten!

Front 22

Hur vill vi att kromatogramtopparna ska se ut?

Back 22

Så smala som möjligt! Då är separationen /tidsenhet bättre

Front 23

Vad är egentligen effektivitet (i detta sammanhang)? Hur räknar man ut effektiviteten?

Back 23

Effektivitet= bandbreddning per tidsenhet eller längdenhet

N = antal teoretiska bottnar

Front 24

Vad är en analyt?

Back 24

Det som skall analyseras

Front 25

Vad är bandbreddning?

Back 25

Effektiviteten; olika ämnen tar olika lång väg genom fasen.

Front 26

Förklara formeln HETP = L/N

Back 26

H =

Front 27

Vad finns det för faktorer som påverkar bandbreddningen? (A-term, B-term, C-term (2 st))

Back 27

Front 28

Hur kan man påverka bandbreddningstermerna?

Back 28

A = eddydiffusion--> Packa kolonn jämnt

B= Diffusion--> Kör kolonnen snabbare

C= motstånd mot masstransport; (Cm--> i gasfasen rör sig ämnet olika snabbt beroende på var i kolonnen det befinner sig

Cs--> i stationärfasen rör sig ämena mellan de olika faserna hela tiden) --> Kör kolonn långsamt så att båda hinner ske!

Front 29

Vad visar Van Deemterkurvan?

Back 29

Att alla bandbreddningstermer spelar in på det slutgiltiga kromatogramresultatet.

Front 30

Vad står H för i kurvan?

Back 30

H = additionen av alla termer som påverkar kromatografin/kromatogrammet. H= höjd ekvivalent till teoretisk botten, ett mått på effektiviteten i kolonnen.

Relaterar varians per enhetslängd av en separationskolonn till den linjära mobilfasen

Front 31

Vad står alla bokstäver för?

Back 31

Cu = C-termen * den linjära hastigheten (m/s)

A = den konstanta A-termen (eddy diffusion)

B/u = Diffusion / den linjära hastigheten

u = den linjära hastigheten (m/s)

H= addition av alla termer som påverkar kromatogrammet

Front 32

Vad ger för resultat bättre selektivitet / bättre effektivitet?

Back 32

Bättre selektivitet ger större avstånd mellan toppar

Bättre effektivitet ger smalare toppar

Front 33

Fördelar med gaskromatografi (GC) jämfört med vätskekromatografi (LC)?

Back 33

Front 34

Nackdelar med gaskromatografi (GC) jämfört med vätskekromatografi (LC)?

Back 34

Substanserna måste vara flyktiga och termostabila eller derivatiseras. (kan göras flyktiga mha derivatisering)

Front 35

Vad innebär derivatisering?

Back 35

Att man kopplar ihop t.ex. AA med en liten organisk molekyl, vilket gör den mer lättlöslig.

Front 36

Vad brukar oftast bärgasen vara i ett GC-system?

Back 36

N2, men ibland också H2 och He. He är dyrt, och H2 riskerar att smälla...

Front 37

Nämn tre olika sorters GC-kolonner. Vilken av dem är vanligast?

Back 37

Packade kolonner (2-4 m långa):

GSC (gas- solid-chromatography), stationärfasen består av adsorbenter t.ex. aktivt kol, silika, molekylskikt

GLC (liquid), stationärfasen är en vätska.

Kapillärkolonner (10-50 m långa):

Bredden är ca 0,2-0,3 mm. Dessa är vanligast

Front 38

Vad står FID för?

Back 38

Flamjonisationsdetektorn

Front 39

Hur fungerar FID?

Back 39

Organiskt material förbränns. I lågan bildas joner och en jonström uppstår. Jonströmmen förstärks av en förstärkare. Ingen respons för t.ex. H2O, NO2, CO2, SO2 m.m. Funkar för ämnen som innehåller kolväten.

Front 40

Hur fungerar en varmtrådsdetektor?

Back 40

Bärgas/ analyt skall vara i balans. Om de ej är i balans så ger de utslag. Fungerar för alt- som en sista utväg för saker som inte syns i FID, t.ex. H2O.

Front 41

Vad detekterar en Elektroninfångningsdetektor (EDC) till största del?

Back 41

Detekterar mest halogenerade ämnen (Cl, Br, osv)

Front 42

Vad är en kvantitativ analys?

Back 42

En integration av topparea. analyserar alltså hur mycket att ämnet vi har.

%A = (ytan av ämnet (toppen) A/ totala ytan av alla toppar) x100

Front 43

Vad måste man ha för att kunna bestämma kvantiteten av ett ämne utifrån ett kromatogram? Vad finns det för olika standarder?

Back 43

För varje ämne man vill kvantifiera måste man först göra en kalibrerkurva. Alla ämnen har olika responsfaktorer vilka bestäms genom att injicera kända mängder och ställa upp responskurvor.

%A = ((ytan av A/r.fakt A)/(totala ytan/r.faktorer) x 100

Standarder: Intern och extern (olika långa upparbetningsprocedurer)

Front 44

Nämn de vanligaste sorterna av vätskekromatografi?

Back 44

- Jonbyteskromatografi

- Size exclusion chromatography (gel filtrering, gelpermeation)

- Affinitetskromatografi

Front 45

Vad finns det för undergrupper till de vätskekromatografiska metoderna?

Back 45

HPLC- high performance liquid chrom.

UHPLC- Ultra high performance...

LPLC - low pressure liq chrom.

LLC (liq/liq)

LSC (liq/solid)

Front 46

På vilka slags molekyler kan man använda HPLC?

Back 46

Front 47

Vad finns det för olika sorters LC?

Back 47

- LLC (liq/liq)- Inert porös massa (diatomejord eller siliagel) impregnerad med den stationära vätskan (får EJ lösa sig i mobilfasen).

- LSC (liq/solid)- Adsorptionskromatografi t.ex. silikaegl, aluminiumoxid, aktivt kol.

Front 48

Vad finns det för olika sorters LC? Forts.

Back 48

Jonbyteskromatografi- syntetiska jonbytare (styren- divinylbensen copolymerer) sulfonsyra- eller kvartenära ammoniumgrupper

SEC- porösa geler (sephadex, porasil m.m.)

Front 49

Förklara hur de 4 vanligaste typerna av LC fungerar

Back 49

vid jonbyte byter analyt plats med motjonen. Vid SEC så kommer störst mol ut först.

Front 50

Nämn ett par fördelar med HPLC (som utförs under tryck på ca 200 bar)

Back 50

- Snabb analys (30s - 1 h)

- Hög upplösning (25k-30k teo bottnar)

- Känslig analysmetod (UV eller fluorescens)

- Även lämplig för preparativt arbete och produktionsskala

- Inga begränsningar som beror på molekylens flyktighet, som vid GC

Front 51

Rita upp en typisk HPLC apparatur!

Tänk på hur ÄKTA ser ut...

Back 51

Front 52

Om en LC-kolonn arbetar under lågt tryck, vad är den vanligaste partikelstorleken? Varför?

Back 52

Gravitationen får provet att gå igenom kolonnen. Partikelstorleken är vanligtvis 30-60 mikrometer

Front 53

Om en LC-kolonn arbetar under högt tryck, vad är den vanligaste partikelstorleken? Varför?

Back 53

En pump ökar trycket i kolonnen, och pressar provet igenom (tänk ÄKTA). partikelstorlek ca 3-5 mikrometer. Vid UHP är partikelstorleken ca 1 mikrometer eller mindre.

Front 54

Hur fungerar ett "normal phase"-system?

Back 54

Mobilfasen är opolär (t.ex. hexan), den stationära fasen är polär (t.ex. silica). Polära ämnen adsorberas hårdare och elueras m lösningsmedel av tilltagande polaritet

Front 55

Hur fungerar ett "reversed phase"-system?

Back 55

Mobilfasen är polär (t.ex H2O, MeOH), stationärfasen är opolär (t.ex. bundna C18-grupper). Opolära ämnen fäster hårdare och euleras med lösningsmedel av sjuknande polaritet.

Front 56

Rita upp hur ett reversed phase/ normal phase system fungerar. Vad fäster, hur eluerar man?

Back 56

Front 57

Ge ett exempel på hur jonbyteskromatografi fungerar

Back 57

Front 58

Vilken laddning har den stationära fasen i en katjonbytare/ anjonbytare?

Back 58

Katjonbytare: negativ, analyten är positiv (och motjonen)

Anjonbytare: positiv, analyten är negativ (och motjonen)

Front 59

Hur eluerar man en katjonbytare/ anjonbytare?

Back 59

Katjonbytare: Eluera med basisk buffert

Anjonbytare: Eluera med sur buffert?

Front 60

Vad är jonparskromatografi, och vad används denna metod till?

Back 60

Används ofta för starkt joniserade substanser

En motjon tillsätts, så att paret blir neutralt- separation kan då ske i ett "reversed phase"-system, eftersom jonparet får affinitet till den poplära stationära fasen.

Front 61

Vad står SEC för?

Back 61

Size exclusion chromatography

Front 62

Vad finns det för "undergrupper" till SEC?

Back 62

Molecular exclusion chrom.

Gelfiltrering

Gelpermeationskromatografi

Front 63

Vad består den stationära fasen av i SEC?

Back 63

T.ex. "beads" av olika storlek, beroende på vad för molekyl man vill rena.

Front 64

Hur bör man välja kromatografimetod? Vad bör man ta med i beräkningen?

Back 64

Front 65

Hur gör man för att optimera ett kromatogram?

Back 65

Man kan t.ex. försöka förbättre effektiviteten, vilket ger smalare toppar. Byte av lösningsmedel, eluera med gradient /isokratisk eluering.

Front 66

Vad är isokratisk eluering?

Back 66

Samma buffert hela tiden, ingen buffertgradient

Front 67

När vill man använda sig av gradienteluering?

Back 67

När det är svårt att särskilja toppar ifrån varandra. Man vill inte att allt ska släppa på en och samma gång. Typiskt exempel är vid jonbyte, då man ökar/minskar jonstyrkan i bufferten gradientvis, för att alla molekyler inte ska släppa samtidigt.

Front 68

Vilka önskemål finns för HPLC-detektorer?

Back 68

- känslig

- linjär (ex "dubbel så hög konc. ger dubbelt så stark signal"

- robust och pålitlig

- kort responstid

- lika känslig för alla ämnen

- liten detektorvolym

- icke-destruktiv (om man vill fortsätta använda sina ämnen efteråt).

Front 69

Ge 4 exempel på detektorer

Back 69

T.ex Absorbans ( UV)

Fluorescens

Elektrokemisk

Refraktionsindex (RI)

Front 70

Vad är respektive detektors positiva egenskaper / begränsningar?

Back 70

Front 71

Berätta lite om tunnskiktskromatografi (TLC)

Back 71

- plan stationärfas (stationärfasbelagd glas- plast-, eller metallfolieplatta. Mobilfasflöde sker mha t.ex. kapillärkraft, tryck, gravitation, elektriskt fält.

Front 72

Nämn några positiva/negativa egenskaper för TLC

Back 72

+ stationärfaser och mobilfaser liknar TLC

+ billigt "snabbtest"

+ Parallella prover

+ 2D separationer möjligt

+ kan detektera m t.ex. Jod, UV el. Fluorescens

- sämre effektivitet jmf m LC

- Svårt att styra mobilfashastigheten