Genetik

Front 1

Forklare principperne for Mendels forsøg med ærter

Back 1

Mendel studerede bl.a. nedarvningen af ærters blomsterfarve. Et kryds (en parring) af individer fra to rentavlende stammer mht. blomsterfarverne lilla og hvid resulterede altid i afkom med lilla blomster. Men krydsedes to individer af dette afkom, F1-generationen, dukkede den hvide blomsterfarve op hos 14 af næste generation, F2-generationen. Forklaringen er, at ærteplanter har to udgaver af samme gen, to alleller, og disse fordeles ligeligt i kønscellerne (Mendels første arvelov). Udgave W koder for lilla blomsterfarve og er dominant i forhold til w, der koder for hvid: Derfor er alle individer med begge alleller (heterozygoterne Ww) lilla. Halvdelen af en heterozygots kønsceller indeholder w, og andelen af afkom, der er homozygote for det hvide gen, udgør derfor 0,5 ×0,5 = 0,25 (eller 25%).

Front 2

Forklare hvad der kendetegner en renavlende linie (pure-breeding line) og en hybrid

Back 2

Renavl:
Afkommet har forældrenes ”udseende”/egenskaber, som forbliver konstant fra generation til
generation (~ renracede)

Hybrid:
Afkom af genetisk forskellige forældre, hvis ”udseende”/egenskaber kan variere fra generation til generation (~ krydsninger)

Front 3

Kende betydningen af de tre generationer: Parental (P), første
filial (F1) og anden filial (F2) samt deres anvendelse i
krydsningsforsøg

Back 3

P:
den generation/de individer, man begynder sine eksperimenter ud fra

F1:
Hybrider/krydsninger mellem rene linier (P).

F2:
Krydsning af to F1-individer.

Hybriderne Medfører øget genetisk variation hos afkom, hvilket kan medføre forbedrede egenskaber.

Front 4

Definere begreberne dominant og recessiv nedarvning

Back 4

Dominant nedarvning:
Det træk, der kommer til syne i F1. Her er en kopi af allelen nok til at sikre den fænotype, som allelen koder for

Ressisiv nedarvning:
Det træk, der ikke kommer til syne i F1, men som ligger skjult i generne, og kan komme til syne i F2. Her skal to kopier af allelen til for at give den fænotype, som allelen koder for.

Front 5

Definere begreberne lokus og alleler

Back 5

Lokus:
Det specifikke sted på et kromosom eller et DNA-molekyle, hvor et givet gen er placeret. Således er genet for hvide øjne hos bananfluen Drosophila melanogaster placeret i white-locus (w) på X-kromosomet, (kaldet 1), 1,5 centimorgan fra den ene ende af kromosomet benævnt position 1-1,5 (se også kobling). Undertiden anvendes begreberne locus og gen i flæng, således at forskellige udgaver af samme gen (alleller) siges enten at være alleller af genet A eller i locus A.

Allel:
En plante har 2 kopier af hvert ”arveanlæg” (gen) – en fra far og en fra mor
Generne kan findes i forskellige ”udgaver” (alleler) fx grøn, gul.
Forskellige alleler kan være dominante (stort bogstav) eller recessive (lille bogstav) i forhold til hinanden
Under dannelsen af kønsceller (æg, sæd = gameter) skilles de 2 alleler ad (segregerer)
Hver gamet indeholder således kun 1 allel af hvert gen
Ved befrugtningen fusionerer en han- og hungamet tilfældigt og danner en zygote, som igen indeholder 2 alleler af hvert gen

Front 6

Definere begreberne fænotype og genotype

Back 6

Fænotype:
En observerbar egenskab, ”udseende”, fx grøn, gul

Genotype:
Allelpar hos et individ, fx Yy, yy eller YY

Front 7

Definere begreberne homozygot og heterozygot

Back 7

Homozygot:
Individ med 2 ens alleler i genotypen, fx YY

Heterozygot:
Individ med 2 forskellige alleler i genotypen, fx Yy

Front 8

Kende principperne for – og være i stand til at
anvende ”produkt-reglen” (både-og) og ”sum-reglen” (enten-eller)

Back 8

Produktreglen (både og) :
Sandsynligheden for at 2 eller flere uafhængige begivenheder indtræffer sammen = produktet af begivenhedernes sandsynligheder.
Fx. sandsynligheden for at slå to tre’ere med to terninger = 1/6 x 1/6 = 1/36

Sumreglen (enten eller) :
Sandsynligheden for at 2 eller flere uforenelige begivenheder indtræffer (de kan ikke optræde samtidig) = summen af begivenhedernes sandsynligheder.
Fx. sandsynligheden for at slå enten en 1’er eller en 2’er = 1/6 + 1/6 =1/3

Front 9

Forklare pricipperne i et ”test-cross” – hvornår bruges den, og hvordan udføres den

Back 9

Ved krydsning med en homozygot ressisiv, vil den ukendte genotype, hvis den er homozygot, altid udvise den dominante fænotype.
Er den ukendte genotype heterozygot, vil den kun vise den dominante fænotype i 50% af afhommet.

Front 10

Kunne opsætte en Punnett square der viser de gameter der kan dannes af forældrene, og den sandsynlige fordeling af eventuelt afkom for både monohybrid og dihybrid krydsninger

Back 10

Punnet square ved monohybrid-kryds (et gen) er Aa x Aa giver 3:1, dihybrid-kryds (to gener) er AaBb x AaBb giver fænotyperne 9:3:3:1. Viser gametres og tilsvarende zygoters genotyper

Front 11

Definere begreberne gamet og zygote

Back 11

Gamet er haploid æg- eller sædcelle / kønscelle, og når de to smelter sammen fås den diploide zygote

Front 12

Forklare Mendels første lov om segregation dvs. principperne for hvordan al-leler fordeler sig under gametdannelsen og kombineres igen ved befrugtning.

Back 12

Første lov, segregation illustrerer ovenstående: de to alleler i et gen adskilles under dannelse af gametre med én allel og smelter sammen i diploid organisme ved fertilisa-tion

Front 13

Forklare Mendels anden lov om uafhængig nedarvning

Back 13

Anden lov, uafhængig nedarvning: fordeling af gen Bs alleler afhænger ikke af for-deling af gen As alleler

Front 14

Have kendskab til opstilling af stamtavleanalyser (pedigree analysis). Kende de anvendte symboler og kunne definere hvad der karakteriserer hhv. domi-nant og recessiv nedarvning i en stamtavle.

Back 14

Stamtavleanalyse: mand er firkant, kvinde er cirkel, ukendt er diamant, udfyldt er syg hvid er rask, dobbeltstreg er beslægtet avl. Dominant giver vertikalt og (sjældent) re-cessivt giver horisontalt pga bærere og syge er ofte indavlede. Hvis alle syge har syge forældre oftest dominant.

Front 15

Forklare de afvigelser der kan ses fra komplet
dominans – dvs. inkomplet dominans og co-dominans.

Back 15

Inkomplet dominans:
Når F1 hybriden ikke ligner nogen af sine 2 renavlende
forældre. (rød + hvid = lyserød)

Co-dominans:
Når begge de 2 homozygote forældres fænotype er til
stede i det heterozygote afkom. Afkommet er blander, men begge forældres egenskaber kan skelnes (sort + hvid = plettet)

Begge udspalter i 1:2:1, dvs hete-rozygotens fænotype kan aflæses. NB. her er tale om ét locus.

Front 16

Forklare hvad der menes med multiple alleler
og dominans serier

Back 16

Multiple alleler:
Finder man hos arten mere end to allele former af genet, taler man om multiple alleler

Dominansserier:
Hvordan forskellige alleler dominerer i forhold til hinanden, når der er flere egenskaber end to.

Front 17

Forklare hvad der menes med at et lokus er
monomorft eller polymorft

Back 17

Monomorf:
Et gen med én vildtype-allel (>1%) er monomorft,

Polymorf:
Et gen med multiple vildtype-alleler er polymorft (små-mutationer regnes altså ikke med).

Allel-frekvens under 1% er mutant og over 1% er vildtype.

Front 18

Forklare letale alleler og deres betydning for
fænotypefordelingen i en krydsning

Back 18

Recessive letale alleler H eller h (med hensyn til overlevelse), den heterozygote over-lever, den homozygote for allelen dør.

Får man en 2:1 fordeling, når man forventer en 1:2:1, så skal man tænke i letalalleller.

Front 19

Forklare begrebet pleiotropi

Back 19

Når et gen bestemmer flere uafhængige egenskaber

Fx kinesisk hårløs hund.
Chrested-allelen er dominant mht. hårløshed
Recessiv mht. lethalitet.
Altså den udviser to egenskaber -> hårløshed og død

Front 20

Forklare hvordan to gener kan påvirke hinanden og give anledning til afvigel-ser fra 9:3:3:1 fordelingen.

Back 20

Et gen kan maskere funktionen af andre og dette kaldes epistasi. Der kommer så færre end fire fænotyper. Fx labrador: sort, brun eller gul. B er sort, bb er brun og i det andet gen har det dominante E ingen effekt mens dobbelt recessiv ee skjuler sort og brun så hunden bliver gul. Den gule e allel er altså epistatisk over for den hypostatiske B-gen. Dette tilfælde kaldes recessiv epistasi (ee er recessiv) P med BBEE sort x bbee
gul -> F1 af ene BbEe sorte.
F2 giver 9:4:3 udspaltning af sort:gul:brun (ville i almin-delig dihybrid give 9:3:3:1 men her er en ekstra gul fordi både B-ee og også bbee giver gul). Skyldes at E koder for melanocyt-producerende hormon -> skift fra gul til
sort pigment. B koder for protein nødvendigt for at melanocyten kan danne sort pigment (men uden melanocyt ingen protein).

Front 21

Forklare begreberne recessiv epistasi og
dominant epistasi

Back 21

Recessiv epistasi:
Homozygoti for den recessive allel i gen 1 dækker over effekten af alleler i gen 2.
Men den dominante allel i gen 1 lader allelerne i gen 2 komme til udtryk.
Bombay fænotype: har blodtype 0, hh maskerer AB fordi H-koder for substans hvor-på A og B sukre adderes. Uden substans H kan de ikke adderes.

Dominant epistasi:
Den dominante allel i gen 1 dækker over effekten afalleler i gen 2.
Men homozygoti for den recessive allel i gen 1 lader allelerne i gen 2 komme til udtryk.
Dominant epistasi: Fx squash. En dominat B- skjuler funktionen af A og gør hvid
mens recessiv bb ikke skjuler og giver A- gul og aa grøn. Ratio 12:3:1 (de tre med lille a som normalt ville være grønne skjules af B-)
Variant: A nødvendig for pigment og B er dominant inhibitor. Giver alle med stort
B+alle med lille aa hvide og A-bb røde. 13:3.

Front 22

Forklare begrebet heterogenitet
Kende princippet i komplementation

Back 22

Heterogenitet:
Alleler i flere forskellige gener kan give den samme fænotype. Eks.: døvhed

Komplementation:
Når 2 forældre med den samme (syge/mutant-)
fænotype, får raskt afkom, er der tale om komplementation og dermed mutationer i forskellige
gener.

Front 23

Definere begreberne penetrans og
expressivitet

Back 23

En genotype udtrykkes ikke altid fuldstændigt eller måske slet ikke.

• Penetrans: Den andel af individer med en bestemt
genotype, som udviser den tilsvarende fænotype (hvor
mange). Komplet eller inkomplet. Bruges primært i
forb. m. dominante alleler.

• Ekspressivitet: Intensiteten hvormed en bestemt
genotype udtrykkes fænotypisk i et individ (i hvor høj
grad). Variabel eller uvariabel.
• Skyldes ”modifier genes” og/eller miljø

Front 24

Give eksempler på, hvordan miljøfaktorer kan
have indflydelse på den fænotypiske
ekspression af en genotype.

Back 24

Enzymet tyrosinase katalyserer
melaninproduktionen (mørkt pigment)
• Siameserkatte:
mutantallel i tyrosinasegenet
temperaturfølsom tyrosinase
funktionelt lavere temperaturer
Det er derfor, at den sorte farve kun kommet til udtryk på ekstraminiteterne - ører, ben, snude.
• Himalaya-kaniner:
også tyrosinase-mutantallel
lignende pelsfarve. Har også sorte ører, næse, ben.

Front 25

Have grundlæggende kendskab til mitose og meiose

Back 25

-Under mitose deler en diploid celle sig i to identiske diploide. Ingen rekombination
-Under meiosen deler en diploid celle sig i 4 haploide datterceller, gametre. Meiose I, interkinese, meiose II. Homologe i bivalent/tetraed deles i anafase I, søsterkromatider deles i anafase II.

Front 26

Kende termer der beskriver kromosomer, herunder begreber som autosomer/kønskromosomer, søsterkromatider, centromer, homologe, karyotype.

Back 26

- De 22 par kaldes autosomer og der er så 1 par kønskromosomer (XX eller XY).
- Søsterkromatider: to 1M eller to 1F forbundet i centromer-region, homologe to 1M og to 1F.
- homologe (AA-aa samme kromosom) og non-homologe (AA-bb ikke samme kromosom)
- karyotype = opstilling. Viser søsterkromatiderne under metafasen.

Front 27

Vide at det kromosomale grundlag for køn
varierer mellem dyrearter

Back 27

Ét kromosompar bestemmer køn. Man fandt x- og y-kromosomer, samt fangede at de bestemte køn, hos græshopper. Dette er systemet hos pattedyr, se fig. 4.3. Gener på Y har betydning for den tidlige kønsudvikling og det er tilstedeværelsen af Y der er afgørende. Hos fugle er den heterozygote kvinden (modsat pattedyr).

Front 28

Have overblik over hvad der sker med
kromosomerne i løbet af cellecyklus (interfase
og mitose) (I behøver ikke huske navne på
mitosens faser (fig. 4.8))

Back 28

G1/G0: cellen vokser og klarer sin normale
funktion. Ex. hjerneceller deler sig ikke og
forbliver i denne fase (G0)
S: DNA syntese/replikation. Alle kromosomer
fordobles => 2 identiske søsterkromatider
G2: cellen forbereder sig til mitose
M: mitose. Vha. tentråde trækkes de 2
søsterkromatider fra hinanden og havner i
hver sin dattercelle

Front 29

Have overblik over hvad der sker med
kromosomerne i løbet af meiosen (I behøver
ikke huske navne på meiosens faser (fig. 4.13))

Back 29

Meiose: 1 diploid celle til 4 haploide rekombinerede datterceller. God fig. 4.13.
Under embryonets udvikling sættes celler til side som kønsceller –dem der laver gametre. Udødelige.
Under meiose I’s profase rekombineres non-søsterkromatiderne (søster-kromatiderne er jo ens) Bivalent=tetraed med fire kromatider. Under anafase trækkes homologe kromosomer fra hinanden (1 og 1) men søsterkromatider holdes stadig sammen (AA deles fra aa), se de to første datterceller har 2n af søsterkromatider dog nu med re-kombination. Søsterkromatider holdes sammen fordi deres kinotochorer er fusioneret.
Mellem meiose I og II har vi interkinesen.
Variation giver mulighed for at tilpasse sig. Variation kommer fra shuffling (2^23) og rekombination. NB i 4.17 ses de 4 gametre fra 2^2: AB, ab, Ab og aB. Pointe: jeg kan lave mange mange forskellige æg.
NB i meiosen holdes de to homologe (duplikere søsterkromatid 1 maternel+duplikeret søsterkromatid 1 paternel) sammen af en synapse-lynlås, så den findes kun i meiosen, da der her skal allignes to homologe sammen i metafase-plan.
Sammenligning s. 96.

Front 30

Vide hvilke processer i meiosen, der bidrager til
genetisk diversitet i gameterne, og hvorfor dette
er vigtigt

Back 30

Den maternelle (m) og paternelle (p) genpulje mixes under
gametdannelsen
• 2 processer sikrer nye kombinationer af m og p alleler

Front 31

Kunne forklare betydningen af begreberne chiasmata, overkrydsning og rekombination.

Back 31

Chiasma = en overkrydsningsbro. Det sted på kromatiderne hvor der sker en overkrydsning. (synligt)
Overkrydsning er når et kromosom par ”bytter” over så allelerne skifter plads.
Rekombination sker ved overkrydsning når kromatider fra homologe kromosomer bytter dele under profasen i meiosis I efter kromosomerne er replicerede. Rekobinationsfrekvensen viser den fysiske afstand. 1%= 1 cM (RF eller m.u.)

Front 32

Kunne forklare begreberne kobling, parentale- og rekombinante kromosomer.

Back 32

når to gener på et kromosom (enten sidder de tæt eller lidt længere fra hinanden) er koblede betyder det at de ofte nedarves sammen. Rekombinations frekvensen skal være <50%. Hvis den er 50% er det tilfældigt udvalgte gener (=gener på forskellige kromosomer eller langt fra hinanden på det samme). Parentale kromosomer er de kromosomer man startede med som udgangspunkt (og dem der ligner???)
Rekombinante kromosomer er dem som har fået byttet en del ud med sit søsterkromatid.

Front 33

Afgøre om gener er koblede på basis af oplysninger om antallet af gameter eller afkom

Back 33

Ved koblede gener vil antallet af afkom der er parentale være meget større end rekombinante.

Front 34

Foretage genetisk kortlægning af 3 gener med angivelse af rækkefølge og genetisk afstand.

Back 34

Udfra afstanden mellem to gener kan man lave en genetisk kortlægning. Ved genetisk kortlægning finder man afstand mellem gen a og b ved at lægge alle de gener sammen der har en overkrydsning mellem lige de to gener sammen og dividere med samlede antal og *100.

Front 35

Afgøre om der er interferens i et genetisk kort med 3 loci

Back 35

Interferens angiver om der er flere eller færre overkrydsninger end forventet. Udregnes I=1-C. Hvor C er obseveret% / forventet%.. resultatet tolkes som (eks. Med I=30%) at der er 30% af overkrydsede gener der mangler pga interferens. ?

Front 36

Kunne forklare begreber som koblingsgruppe og koblingskort.

Back 36

Koblingskort viser placering af koblede gener. Koblingsgruppe er en gruppe af koblede gener,

Front 37

1. Beskriv hvad der kende tegner hhv. en nonsense, missense og en silent mutation. Hvad kan konsekvenserne være af de 3 mutationstyper på proteinniveau?

Back 37

SVAR: En nonsense mutation bevirker at en codon erstattes af en stopcodon. Sådan en mutation resulterer i et kortere (trunkeret) protein. En missense mutation bevirker at en aminosyre erstattes af en anden. Hvis den aminosyre, der bliver sat ind i proteinet, har helt andre egenskaber (altså en non-konservativ missense mutation) kan det få betydning for foldning af proteinet eller for funktionen af et aktivt site. Er der derimod tale om en conservativ missense mutation, har den sandsynligvis mindre eller ingen konsekvenser for proteinet. En silent mutation ændrer codon til en anden codon, der koder for samme aminosyre. Der er derfor ingen ændring i proteinet.

Front 38

2. Hvad er en deletion og hvad er en insertion? Nævn et eksempel på hvordan disse 2 mutationer kan opstå (tegn gerne). Hvordan kan en insertion påvirke læserammen?

Back 38

SVAR: En deletion opstår når et eller flere nukleotidpar mistes fra DNA’et. En insertion opstår når et eller flere nukleotidpar indsættes i DNA’et.
En skæv overkrydsningen i meiosen, hvor de 2 kromatider krydser lidt forskudt af hinanden, vil give anledning til en deletion på det ene kromatid og en insertion på det andet kromatid. Replikation af repeatområder i DNA’et kan få replikationsmaskineriet til at falde af og starte igen med risiko for at replikere det samme repeat flere gange eller springe repeats over. Dette kan medføre hhv. insertion eller deletion af repeats.
Når et antal nukleotidpar, som ikke er deleligt med 3, sættes ind i en kodende sekvens, vil læserammen forskydes, da 3 baser koder for en aminosyre. Er der fx. tale om en insertion på 2 nukleotidpar, vil aminosyrekodningen være ændret fra mutationspunktet og resten af sekvensen ud.

Front 39

4. Beskriv kort DNA-polymerasens funktioner. Nævn mindst 1 anden mekanisme, der kan rette eller reparere fejl eller mutationer i DNA’et.

Back 39

SVAR: DNA-polymerasen tilføjer nukleotider til den voksende DNA-streng under replikationen, men samtidig har den en proofreading-funktion, som i tilfælde af fejl, fjerner ”forkerte” nukleotider og sætter rigtige ind i stedet.
Nukleotid excision repair
Methyl-directed mismatch repair

Front 40

5. Nogle mutantalleler af beta-hæmoglobingenet giver abnormt lange mutantproteiner.
Hvad kan forklaringen være? I hvilke sites vil det være fornuftigt at lede efter en mutation, når proteinet er længere end forventet?

Back 40

Det kan skyldes et indehholdt intron eller fortsat translation efter stopcodon. I så fald kan mutationen findes i et splice site eller i stopcodon.

Front 41

7. Hver gang et gen skal udtrykkes, gør cellen brug af en lang række genekspressionskomponenter. Dvs. molekyler, enzymer mm. som sørger for hvert enkelt trin i ekspressionen. Nævn mindst 2 af disse komponenter og deres overordnede funktion. Hvordan vurderer du effekten af en ødelæggende mutation i et gen, der koder for sådan en komponent?

Back 41

SVAR: RNA polymerase katalyserer syntesen af RNA molekylet i transkriptionen. tRNAmolekyler sørger for at de rette aminosyrer bliver koblet på den voksende proteinstreng – guidet af mRNA molekylet. Ribosomer hjælper bindingen mellem tRNA og mRNA og katalyserer bindingen mellem aminosyrerne i den voksende proteinstreng. Spliceosomproteiner sørger for at introns bliver splicet ud af det primære RNAtranskript.
De cellulære genekspressionskomponenter er vitale for cellen. Uden dem kan generne ikke udtrykkes. Derfor vil en alvorlig mutation i et gen, der koder for en af disse komponenter have alvorlige eller lethale konsekvenser.

Front 42

Have kendskab til hvordan mutationer udenfor de
kodende regioner kan påvirke genexpressionen

Back 42

• Mutationer i ikke-kodende sekvens har effekt på:
• Start og stop af transskription (promotor, terminator)
• Splicing af exons (splicesites)
• Ribosombinding (ribosombindingssite)
• Mutationer i kodende sekvens har effekt på:
• Aminosyresekvensen

Front 43

Kunne definere mutationstyperne missense-, silent, nonsense-og frameshiftmutationer (i kodende regioner) og beskrive
hvordan de kan ændre genproduktet

Back 43

• Silent mutation: ændrer ikke aminosyren
• Missense mutation: ændrer aminosyren
• Nonsense mutation: genererer stopcodon
• Frameshift mutation: ændrer læserammen

Front 44

Kende eksempler på betydningen af mutationer i ”cellulære
komponenter” (tabel 8.3)

Back 44

-Transkription (ex. Polymerase)
-Splicing (ex. Spliceproteiner)
-Translation (ex. tRNA)
-Proteinmodifikation
Lethale / alvorlige

Front 45

Reading frame

Back 45

En åben readingframe har ingen stopcodon. En lukket readingframe har stopcodon. Et exon skal have åben reading frame (ellers stopper proteinet jo). Hvis man har to se-kvenser og den ene har 0 eller én åben reading frame, mens den anden har to, er det altså den sidste der er exon.
Insertion har stor effekt som mutation da hele den efterfølgende reading-frame æn-dres. Frameshift mutation, se eksempel slide 6.

Front 46

Silent mutation

Back 46

-Genproduktet kan ændres ved mutation i den kodende sekvens. Silent mutation æn-drer ikke aminosyren (mest udbredt på tredje nukleotid).

Front 47

Missense

Back 47

-Missense substituerer én aminosyre. Missens kan være konservative ændrer positiv til anden positiv, mens non-konservativ ændrer fysisk egenskab.

Front 48

nonsense

Back 48

-Nonsense er mutation som giver stop-koden og man får derfor et halv protein som er helt dysfunktionel.

Front 49

Mutation i non-kodede regioner

Back 49

Genekspression kan også ændres ved mutation i non-kodende region. Fx promotor og terminator. Splejsesteder viser, hvor exons skal sættes sammen, så mutation her kan give andre eller dysfunktionelle proteiner. Ribosomale bindingsites (startcodon) kan mutere så ribosomet ikke kan binde. Mutation i stopcodon giver for lange og dysfunk-tionelle proteiner. Mutation i gen for rRNA, tRNA er oftest dødelige. Ligeså enzymer som kinase, fosfortase m.m. Nonsense supressor tRNA.

Front 50

Mutationstyper

Back 50

Mutationstyper: substitution (punktmutation), deletion (mister 1 eller flere nukleotid-par), insation (af 1 eller flere par), inversion (roteres rundt, dvs både deletion og insa-tion), translokation (fra ét sted til et andet i non-homologe, meget udbredt i evolutio-nen).
I substitutionsmutationer er transition: A og G eller T og C, dvs purin for purin og py-rimidin for pyrimidin (Huskeregel CT-scannner) mens transversion er purin <->pyrimidine.

Front 51

Vide hvad promotor, terminator, exon, intron og
UTRs er samt deres inbyrdes ”placering”

Back 51

Promoter - starter transkribtion
Terminator - slutter transkribtion
exons - Dele af DNA, der koder for aminosyrer.
introns- Dele af DNA, der ikke koder for aminosyrer.
UTR - 5'- og 3'-utransla-terede sekvenser i mRNA’et

Front 52

DNA analyse teknikker

Back 52

• Restriktionsenzymer (Skære DNA’et i mindre stykker)
• Gelelektroforese (Sortere stykkerne efter str. )
• Kloning (Sætte stykkerne i en holder – til evt. senere brug og
kopiering)
• Hybridisering (Udpege et bestemt stykke i en større mænde af
forskellige stykker)
• PCR (Kopiere et mindre, kendt stykke)
• Sekventering (Læse baserækkefølgen)

Front 53

Kende principperne for anvendelse af
restriktionsenzymer og gelelektroforese

Back 53

-Restriktionsenzymer: genkender og klipper bestemte sekvenser, 4-6-8 bp palindrom, for hver 4^n bp. Blunt ends er lige, sticky er skæve. Komplet digest skærer alle og partiel kun nogle.
-Gelelektroforese adskiller DNA-fragmenter på baggrund af størrelse. Går mod+, små vandrer længst.

Front 54

Beskrive de væsentligste step i kloningsprocessen

Back 54

1. Ligere DNA-fragmentet til vektor -> rekombinant DNA-molekyle. 2. Værtscellen optager og amplificerer rekombinant DNA-molekyle til DNA-klon 2a. få fremmed DNA ind i cellen. 2b. Udvælge celler, der har optaget vektor. 2c. Genkende celler med insert i vektor (gul ikke blå). 3. Adskillelse af plasmid+insert fra celle og af insert fra plasmid

Front 55

Forstå hvad et genomisk bibliotek eller et cDNA bibliotek er

Back 55

Et genomisk bibliotek består af cellulære kloner med restriktionsfragmenter af hele genomet. Kræver normalt 4-5 genomiske ekvivalenter

Front 56

• Forstå pricippet bag Southern Blot

Back 56

restriktionsenzymer skærer, gelelektroforese, aftryk og hybridisering med probe. Kan finde det bånd som indeholder ønsket DNA,

Front 57

• Forstå PCR teknikken

Back 57

PCR amplificerer DNA-sekvens mellem oligonukliotid-primere tidligere sekventeret

Front 58

• Forstå princippet ved sekventering samt kunne læse og forstå DNA sekvente-ringsgeler.
• Beskrive hvilke af de ovenstående teknikker der er relevante til løsning af en given genetisk problemstilling

Back 58

-Sangers dideoxy: radioaktive primere + ATCG samt få af én slags dideoxy i 4 glas. Hver slags stopper efter hver tilsvarende base. I gelelektroforese med 4 baner kan streger tælles og det er komplementær (!) streng. Husk minus til plus
-Effektiv sekventering: hver ddX er mærket med sin farve, så man kun har et glas og en bane i gelelektroforese. Maskine aflæser farve-kombination.
-Primerwalking: Bruger det sidst sekventerede stykke som primer for det næste. Kan bruges som led i shotgun

Front 59

Hvad er cDNA?

Back 59

• cDNA: complementary DNA
• Komplementært til mRNA
• Fremstilles vha. revers transkriptase (oversætter mRNA
til cDNA)
• Repræsenterer kun kodende regioner (exons)
• Hvorfor ikke bare bruge mRNA?

Front 60

Hybridisering

Back 60

Hybridisering: når 2 enkeltstrengede, komplementære
DNA (eller RNA)-molekyler danner et dobbeltstrenget
molekyle
• Bruges når man skal udpege et bestemt stykke DNA i en større mængde af forskellige stykker

Front 61

• Sekventering

Back 61

• Sekventering: ”læse” rækkefølgen af baser i et DNAfragment
• Formål: forudsige aminosyresekvens, finde mutationer, sammenligne
gensekvenser hos species etc.
• Kræver forudgående amplifikation/kopiering (PCR eller kloning) af
targetsekvensen (DNA fragmentet man er interessereti)
• Flere metoder – her: Dye terminator Sanger-sekventering (Fred Sanger)

Front 62

Hvilke ”ingredienser” bruger man til hhv. PCR, cDNA syntese og sekventering?

Back 62

PCR: DNA, left og right primere, DNA-polymerase, dNTP’er
cDNA syntese: mRNA, revers transkriptase, oligo dT primer, dNTP’er
Kun hvis cDNA’et skal klones, laver man dobbeltstrenget cDNA. I så fald tilsættes også DNA polymerase.
Sekventering: Target DNA, 1 primer, DNA-polymerase dNTP’er, ddNTP’er

Front 63

Hvad er cDNA og hvordan syntetiseres det? Hvad er forskellen på sekvensen af et gen fra henholdsvis genomisk DNA og cDNA?

Back 63

cDNA er mRNA der er transkriberet til DNA ved hjælp af enzymet reverse transcriptase. Det er altså en slags ”DNA-udgave” af mRNA’et. mRNA er ustabilt og degraderer let. Derfor laver man det om til cDNA, når man skal arbejde med mRNA sekvenser.
Man isolerer mRNA fra en vævsprøve og syntetiserer cDNA’et vha revers transcriptase. Udgangspunktet for syntesen er en poly-T primer, som hæfter sig på mRNA-molekylernes poly-A hale. Kun hvis cDNA’et skal klones, laves det dobbeltstrenget. I så fald udnyttes, at den syntetiserede cDNA-streng kan lave et loop og fungere som primer i syntesen af den komplementære, 2. cDNA-streng. Hertil bruges DNA polymerase.
Efter transkriptionen af et gen, splices introns ud af det primære transcript, hvorved mRNA dannes. cDNA, som jo er komplementær til (og syntetiseret ud fra) mRNA repræsenterer derfor kun exons, dvs. genets kodende regioner. Genomisk DNA indeholder både introns og exons.

Front 64

Den recessivt nedarvede sygdom spinal muskelatrofi hos katte skyldes en deletion på 140 bp. Beskriv hvordan man kan bruge PCR og gelelektroforese til at genotype katte for sygdommen. Hvordan vil gelbilledet se ud for de 3 genotyper hhv?

Back 64

Det område i DNA’et, som indeholder (eller ikke indeholder) mutationen skal amplificeres vha. PCR. Derfor starter man med at designe primere, der er komplementære til sekvenser på hver sin side af mutationsstedet. PCR-produktets str. afhænger bl.a. af hvor langt fra mutationsstedet primerne annealer. Hvis PCR på en rask allel giver et produkt på 200 bp, vil PCR på mutantallelen give et produkt på 60 bp. Når man loader sit PCR-produkt på gelen, vil man se flg. for de 3 genotyper:
Homozygot rask: et tykt bånd på 200 bp (har rask allel på begge homologe)
Syg: et tykt bånd på 60 bp længere nede på gelen (har mutantallel på begge homologe)
Heterozygot: et bånd på 200 bp og et bånd på 60 bp (har en rask allel på det ene og en mutantallel på det andet homologe kromosom.

Front 65

Ved Dye-terminator Sangersekventering tilsættes dideoxynukleotider (ddNTP) og deoxynukleotider (dNTP) i forholdet 1:100. Hvilken funktion har dideoxynukleotiderne?
Tegn sekventeringsgelen efter sekventering af DNA-fragmentet:
3’- (primersite)-ATGCCGATAT -5’
ddNTP-farver: ddCTP (blå), ddATP (grøn), ddGTP (gul), ddTTP (rød)

Back 65

Når et dideoxynukleotid indsættes i den streng som DNA-polymerasen syntetiserer, stoppes processen og strengen bliver ikke længere. Det skyldes at dideoxynukleotidet mangler oxygen i 3’ positionen af sukkermolekylet og derfor kan der ikke sættes en ny base på. Når sekventeringsreaktionen er kørt til ende har man derfor en blanding af fragmenter af forskellig længde som kan separeres ved hjælp af gel-elektroforese.
Den komplementære DNA-streng, som dannes under sekventeringen får sekvensen: 5’-TACGGCTATA-3’ men syntesen vil i forskellige fragmenter være stoppet med et ddNTP på forskellige positioner. De korteste fragmenter vil være afsluttet med et rødt ddTTP. Det nederste bånd på gelen bliver derfor rødt osv. Rækkefølgen af båndene på gelen bliver derfor (nedefra):
Rød, grøn, blå, gul, gul, blå, rød, grøn, rød, grøn

Front 66

Antag at du har to reagensglas med identisk genomisk DNA. Til det ene reagensglas tilsættes NotI (5’GC▼GGCCGC3’) og til det andet tilsættes Sau3AI (5’▼GATC3’). Efter skæringen med enzymer køres en gel elektroforese med DNA fra de to glas. Hvor lange fragmenter (gennemsnitligt) genererer de 2 enzymer? Hvilke DNA fragmenter løber længst på gelen?

Back 66

Fragmentlængden beregnes vha. 4n-reglen: fragmentlængden = 4n (n= antal baser, som enzymet genkender). NotI genkender 8 baser og genererer derfor 48 = 65.5 kb lange fragmenter. Sau3AI genkender 4 baser og genererer 44 = 256 bp lange fragmenter. Sau3AI skæringsfragmenterne løber længst på gelen. Korte framenter har nemmere ved at ”bevæge sig igennem gelen” end lange og de når derfor længst pr tidsenhed.

Front 67

En kloningsvektor indeholder typisk et Ampicillin resistensgen. Hvordan udnyttes dette i kloningsteknikken?

Back 67

De bakterier, som er blevet transformeret (= har optaget en vektor) bliver derved ”udstyret” med et Ampicillin resistensgen. Ved at så bakterierne ud på en Ampicillinholdig agarplade, kan man frasortere de bakterier, som ikke er blevet transformeret.

Front 68

Hvad betyder det hvis gener er paraloge og kan du nævne et eksempel

Back 68

Gener der er duplikeret mange gange indenfor den samme art. Eksempler på paraloge gener er olfaktorie-receptor generne eller rhodopsin generne.

Front 69

Du vil gerne sammenligne ekspressionen af gener i raskt og betændt lungevæv v.h.a. et microarray. Beskriv kort alle trinene i proceduren. Hvordan tolkes de 3 farver?

Back 69

mRNA oprenses fra hhv. sygt og raskt væv og herudfra syntetiseres cDNA. cDNA’et fra det syge væv mærkes med rød fluorescens og cDNA’et fra det raske væv mærkes med grøn fluorescens. De 2 cDNA’er blandes og hældes ud på et microarray til hybridisering. Microarray’et er et lille stykke glas hvorpå en masse oligonukleotider, som hver repræsenterer et gen, er sat fast. Man kender de nøjagtige koordinater for hvert ”gen”. Et rødt signal indikerer overvejende hybridisering med cDNA fra sygt væv. Det tilsvarende gen er derfor kraftigere udtrykt i sygt end i rask væv. Et grønt signal indikerer overvejende hybridisering med cDNA fra raskt væv. Det tilsvarende gen er derfor kraftigere udtrykt i raskt end i sygt væv. Gult signal indikerer lige hybridisering med de 2 cDNA’er. Det tilsvarende gen er derfor lige højt udtrykt i sygt og raskt væv.

Front 70

Gener

Back 70

• Homologe gener: gener, der har en fælles oprindelse i den
evolutionære historie
• Orthologe gener: gener i forskellige species, der stammer fra
det samme gen i en fælles forfader
• Paraloge gener: gener hos den samme art opstået ved
duplikation (samme familie)

Front 71

Genfamilier

Back 71

Beslægtede gener - stammer fra et oprindeligt gen
Eksempel: Den olfaktoriske genfamilie
(koder for olfaktoriske receptorer = OR)
- 1 stamgen duplikeret 20 gange og divergeret
- Duplikation + translokation af de 20 gener til 30 forskellige sites
- Alle de 30 sites har nogle af / alle de oprindelige 20 gener
- Hunde har større clustre af OR gener end mennesker

Front 72

Vide hvad microarray er og hvad det kan bruges til

Back 72

• PCR-amplificerede
genfragmenter spottet
på glasslide
• 5-40.000
• Hybridisering med
cDNA fra fx sygt og
raskt væv
• Sammenligning af
expression

Front 73

• Genkende og beskrive forskellige typer af DNA
polymorfier/markører

Back 73

-DNA polymorfismer kan deles i 4 klasser. 1. SNPs 2. SSRs=mikrosatelitter 3. Mini-satelitter 4. Deletion, duplikation, insertion i nonrepeat locus.
-SNPs: simpleste, enkelt base substitution, de fleste ligger i denne kategori (100 mil-lioner loci i populationen), de fleste er biallele med meget forskellige rater mellem de to, fx 50:50 eller 1:100. Hovedsageligt i anonyme loci (ellers kan primærsekvens æn-dres). Da replikationssystemet er så pålideligt mener man at hver enkelt SNP er kommet fra én mutation, så hvis to mennesker har en SNP tilfældes har de den fra samme forfar (meget anvendt i slægtskabsanalyse). Kan bruges som DNA markers. Rate som DNA-replikations med proofreading+mismatchrepair dvs 10^(-9).
-Mikrosatelitter: I både menenskers og andre komplekse organismers genom findes masser af repeated sekvenser. Mikrosatelitter er 1, 2 eller 3 bp som gentages i tandem 15-100 gange. En kort mikrosatelit opstår tilfældigt og kan øges i længde fordi DNA polymerase snubler jf 11.3 -> mange forskellige alleler. Der kommer nye alleler med en rate af 10^(-3), kan derfor ikke bruges til at analysere slægtskab langt tilbage, men er ok til nogle generationer. Antal: 200.000 loci i populationen
-Minisatelitter: er større end mikrosatelitter, dvs selve den repeterede sekvens kan væ-re 20-100 bp lang og kan gentages op til 1000 gange. Er meget polymorfe fordi al-lignment i metafaseplanen let kan forskubbes -> duplication+deletion. 30.000 loci i populationen
-Andre: mutagene ændringer som forkorter eller forlænger NON-repeterede sekven-ser. Skyldes unequal crossover under rekombination, se 11.5, eller pga insertion af TEs. Ikke særligt almindelige.

Front 74

Beskrive de væsentligste step i kloningsprocessen.

Back 74

Kloning er at lave en identisk kopi.
Molekylær kloning:
isolering (fra andet DNA) – DNA der er en specifik størrelse sætter sig på en vektor (fake-kromosom). Vektoren fungerer som transport/holder molekyle og er også nødvendig for replikation og ”renhed”.
Kopiering – vektoren med DNA stykket transporteres ind i en levende celle og den starter replikationen.
Trin:
1) Ligering i vektor – DNA sættes fast i transportmolekylet/holderen).
Vektoren åbnes med det samme restriktionsenzym som DNA’et er skåret med. DNA-stykkerne ligeres (sættes fast) i vektoren med ligase. DNA er nu ”insert”
2) Transformering – Vektoren transporterer DNA’et ind i en værtscelle og sørger for kopiering ved opformering.
Rekombinant vektor (?) og E.coli blandes (værtscellen). Vektoren optages i E.coli enten ved hjælp af CaCl2 eller strøm. (succesraten er 0.1%) under bakterievæksten kopieres vektoren og insertet (DNA fragmentet) også. For at man kun skal kunne se de E.coli der indeholder vektor og insertet dyrkes bakterierne på et ampicillin medie. E.coli er ampicilinfølsomt, men vektoren indeholder ampicilinresistens og derfor er det kun E.coli der indeholder vektoren der gror.
Man kan se om vektoren indeholder et insert da det har et lac-Z gen der kan spalte x-gal (som er tilsat i mediet der også indeholder ampicillin) og når x-gal spaltes udskilles blåt pigment. Der er altså ikke et insert hvis bakterien ”er” blå. Hvis der derimod er et insert i vektoren sætter det sig på restriktionssitet der sidder midt i lac-Z genet og derfor kan x-gal ikke spaltes og bakterien vil ikke være blå.
Beskrive den grundlæggende opbygning af en kloningsvektor.
En vektor er et DNA-molekyle der kan bruges som holder i kloning. De mest brugte er plasmider, der er et cirkulært DNA-molekyle som findes naturligt i bakterier og har flere genkendelsessites for flere restriktionsenzymer. Når restriktionsenzymet sætter sig på genkendelsessitet åbnes vektoren ved det modsvarende genkendelses site og giver mulighed for insertion af DNA-fragmentet uden at vektoren går i stykker.
Vektoren besidder:
replikationsstart/origo der gør det muligt at replikerer uafhængigt inden i en bakterie.
Restriktionssites gør at DNA’et ikke bliver blandet sammen med DNA’et fra bakterien (?)
antibiotikaresistensgener: gør det muligt at udvælge de bakterie celler der indeholder plasmider.
Selektionsmarkør: gener der, enten er antibiotika resistente eller på en anden måde, gør det muligt at udvælge celler der indeholder/holder et specifikt DNA molekyle.

Front 75

Kende principperne for anvendelse af restriktionsenzymer og elelektroforese.

Back 75

Restriktionsenzymer skærer DNA i mindre stykker. Restriktionsenzymet stammer fra bakterier (beskytter mod virus?) og det genkender og skærer specifikke restriktionssites (palindromer). Enzymet kan enten skære DNA strengen lige over = blunt ends, eller i zigzag = sticky ends. Restriktionsenzymet kan inddeles i 4-base-cutter eller 6-base-cutter. 4-base-cutter genkender en speciel sekvens af 4 baser og afhængigt af enzymet skærer den et bestemt sted i de 4 baser. 6-base-cutter fungerer på samme måde men med 6 baser.
Da de 4 baser forekommer lige hyppigt og tilfældigt i genomet kan man beregne fragmentlængden ved 4n reglen. 4-base-cutter: 44=256 bp (længden af det stykke DNA der klippes ud). 6-base-cutter 46=4096 bp. Enzymet vil skære alle restriktionssites ved ”ubegrænset” tid = complete digest. Ved kortere tid skæres kun nogle sites, dette kaldes partial digest.

Gelelektroforese sorterer DNA-fragmenterne, som restriktionsenzymerne har skåret ud, efter størrelse (antal bp). Elektroforese er bevægelsen af ladede molekyler i et elektrisk felt. Fordi phosphat rygraden i DNA er negativt ladet i neutral PH værdi vil stykkerne bevæge sig mod +. Der er flere variable der afgører hvor langt et molekyle bevæger sig i elektroforesen: Styrken af det elektriske felt, sammensætningen af gelen, molekylets ladning og størrelsen på molekylet. Da der er (ca.) samme ladning i alle nukleotideparene (og gelen og styrken af det elektriske felt) er den samme er det altså kun molekyle størrelsen der varierer. Derfor kan man bruge gelelektroforesen til at afgøre længden af DNA fragmenter i forhold til hinanden.

Front 76

Hybridisering:

Back 76

Hybridisering:
Hvis man gerne vil finde et specielt klon i det genomiske bibliotek kan man bruge cDNS sekvensen til at hybridisere/udpege med. Hybridisering er når 2 enkeltstrengede, komplementære DNA eller RNA molekylder danner et dobbeltstrenget molekyle.
I praksis gør man det at man sår bibliotekets kloner ud på en plade, (celler lyseres og DNA denatureres), den mærkede probe (det cDNA stykke der passer til det man vil finde) tilsættes og kolonier med hybridisering kan ses.

Front 77

Kunne beskrive hvad et genomisk bibliotek og et cDNA bibliotek er.

Back 77

Et genomisk bibliotek er en samling af kloner der tilsammen indeholder kopier af samtlige sekvenser i hele genomet.

cDNA bibliotek:
cDNA er complementary DNA og man kan sige at det er komplementært til mRNA. Det fremstilles ved hjælp af reverse transkriptase der oversætter mRNA til cDNA og på den måde indeholder det altså kun kodende regioner (exons).
cDNA er smart fordi 3’ enden kan folde op og fungere som primer og på den måde bliver der syntetiseret nyt cDNA helt a sig selv (kræver dog at de 4 deoxynukleotider og DNA polymerase er til stede).
cDNS biblioteket er altså derfor en samling kloner der tilsammen indeholder den kodende sekvens af gener der udtrykkes i et væv. Forskellige gener udtrykkes i forskellige væv (fx leverbibliotek, lungebibliotek osv.) og sekvenser er repræsenteret i samme grad som de udtrykkes.

Front 78

Kunne beskrive de enkelte processer i PCR teknikken.

Back 78

PCR = Polymerase Chain Reaction. Kopiering af en mindre , specifik sekvens. (>4 mill. Kopier)
Man kan bruge det til at undersøge en lille sekvens, fx et gen, nærmere. Evt for at finde mutationer. Det kræver mange kopier af sekvensen.
Til PCR skal der bruges: DNA, Primere (left+right), enzym (polymerase) og dehydroxynukleotider (byggeklodserne)
Et nukleotid består altid af 1 sukkermolekyle, 1 phosphatgruppe og en af de 4 baser (A, T, G, C).
Trin for trin:
1. syntese af primeren
to små stykker DNA (ca 20 bp.) der er komplementære til de sekvenser der ligger lige udenfor targetsekvensen, (en til højre og en til venstre for) syntetiseres. Pga komplementariteten (de er ens) kan primerne finde og sætte sig fast tæt ved targetsekvensen.
Reaktionen starter derfor ved primerne der forlænges når DNA’et kopieres. DNA strengen forlænges altid i 3’ enden.

2. selve reaktionen.
Denaturering (de 2 komplementære strenge skilles ad)
Annealing (primere sætter sig fast)
Polymerisering (de 2 primere forlænges)

Denne cyklus gentages 25-35 gange og de nysyntetiserede strenge kopieres også i hver cyklus.

Front 79

Kunne beskrive princippet bag sanger-sekventering samt kunne læse og forstå DNA sekventeringsgeler.

Back 79

Kunne beskrive princippet bag sanger-sekventering samt kunne læse og forstå DNA sekventeringsgeler.
Sekventering er at læse rækkefølgen af baser i et DNA fragment. Man gør det for at kunne forudsige aminosyresekvensen, finde mutationer og sammenligne gensekvenser hos species osv.
Det kræver at man har kopieret/amplifikeret det DNA fragment man er interesseret i (target sekvensen). Dette gøres enten ved kloning eller PCR.

Front 80

Genkende og beskrive forskellige typer af DNA
polymorfier/markører

Back 80

-DNA polymorfismer kan deles i 4 klasser. 1. SNPs 2. SSRs=mikrosatelitter 3. Mini-satelitter 4. Deletion, duplikation, insertion i nonrepeat locus.
-SNPs: simpleste, enkelt base substitution, de fleste ligger i denne kategori (100 mil-lioner loci i populationen), de fleste er biallele med meget forskellige rater mellem de to, fx 50:50 eller 1:100. Hovedsageligt i anonyme loci (ellers kan primærsekvens æn-dres). Da replikationssystemet er så pålideligt mener man at hver enkelt SNP er kommet fra én mutation, så hvis to mennesker har en SNP tilfældes har de den fra samme forfar (meget anvendt i slægtskabsanalyse). Kan bruges som DNA markers. Rate som DNA-replikations med proofreading+mismatchrepair dvs 10^(-9).
-Mikrosatelitter: I både menenskers og andre komplekse organismers genom findes masser af repeated sekvenser. Mikrosatelitter er 1, 2 eller 3 bp som gentages i tandem 15-100 gange. En kort mikrosatelit opstår tilfældigt og kan øges i længde fordi DNA polymerase snubler jf 11.3 -> mange forskellige alleler. Der kommer nye alleler med en rate af 10^(-3), kan derfor ikke bruges til at analysere slægtskab langt tilbage, men er ok til nogle generationer. Antal: 200.000 loci i populationen
-Minisatelitter: er større end mikrosatelitter, dvs selve den repeterede sekvens kan væ-re 20-100 bp lang og kan gentages op til 1000 gange. Er meget polymorfe fordi al-lignment i metafaseplanen let kan forskubbes -> duplication+deletion. 30.000 loci i populationen
-Andre: mutagene ændringer som forkorter eller forlænger NON-repeterede sekven-ser. Skyldes unequal crossover under rekombination, se 11.5, eller pga insertion af TEs. Ikke særligt almindelige.

Front 81

Have kendskab til de teknikker der anvendes til at
detektere de forskellige markører

Back 81

Udtage DNA, klone og sekventere dur ikke, fordi man ikke kan være sikker på at ha-ve begge personens alleler.

3 andre teknikker til at finde SNPs (bemærk):
Alle starter med PCR.ø
1. Southern blot + PCR: hvis den ændrer skæringssted for restriktionsenzym. Herefter separation via gelelektroforese og aftryk på southern blot så der kan hybridiseres pro-pe. Restriction fragment lenght polymorfism, RFLP. Bruges under diagnosticering af seglcelleanæmi, se 11.7. Ulempe: Kun RFLP
2. Allel-specifik oligonukleotid (ASO) hybridisering: Gøre høstakken mindre ved at lave PCR af mindre stykke med nukleotiden. Hvorfor ikke bare sekventere herfra? (dyrt). Når kun ca 25 bp lang bliver helixen ustabil af bare én mismatch. SNP er jo biallel, så man laver probe af dem begge og ved at højne til kritisk temperatur ses efter denaturering. Ved 80 grader holdes sammen selvom mismatch. Ved 90 grader de-naturerer den med mismatch men ikke den fuldt komplementære. Ved 100 grader de-naturerer de begge. 18-24 bp lange prober som kun hybridiserer når uden mismatch kaldes ASOs. Der hvor der er plet er de hybridiseret. Hvis der er plet ved begge SNP-alleler er locus heterozygot
3. Single nukleotid primer forlængelse: Den mest akkurate. DNA denatureres og der tilsættes primere som passer lige ved siden af mutationen. Så kommer DNA polyme-rase og én dideoxy som passer til den ene allel, se 11.11. Den ene allel stopper og den anden forøges med 1 og stopper så. Den strengs primer som passer med ddX stopper altså her. Homozygot for allel 1: kun 14 bp primere, homozygote for allel 2: kun 13 bp primere. Heterozygote har både 13 og 14. Kan findes med gelelektroforese eller ’Time-to-Flight spektrometri’, bruger også størrelse men måler fart af klatter (små er hurtigst). Bemærk biallel. Bemærk, hvis ddCTP tilsættes i reaktion giver ingen reak-tion og derfor også alleler på 13 bp. De komplementære strenge er altså ikke vigtige, selvom individet var heterozygot.

Finde andre polymorfier:
SNPs har nukleotid-variation. Det har de andre ikke, bare forskellig størrelse af locus og findes via færst PCR med primere på begge sider af sekvensen og så gelelektrofo-rese.
-Mikrosattelitter er meget brugte, fordi de findes mange steder i genomet hos alle ver-tebrater og er lette at skelne. Er normalt i nonkodende sekvenser, men for eksempel med Huntingtons korea ligger der en mikrosatelit (CAG-trinukleotid) i den kodende og den giver mutant-alleler. Autosomal dominant, høj age of onset. Normal allel: op til 34 gentagelser, syg allel: 42 eller flere gentagelser og jo flere jo tidligere age of onset, se 11.13.
-Minisatelitter: Sjældne, skærer med restriktionsenzymer lige udenom kendt locus og laver southern blot. Kan bruges til DNA fingerprint; kan tager et dusin loci og ser på om to prøver har ens minisatelit alleler. Eksempel i opg 11.12. Her samenlignes længder af restriktionsenzymer som normalt. Barn skal kunne føre alle tilbage til enten mor eller far.
P=0,375^n (FBI bruger 13 loci) Bruges rigtig meget i retsmedicin og til at opklare forbrydelser.

Grænse for kobling er en LOD-score på 3

Front 82

DNA-markør

Back 82

DNA-markører, dvs.
markører hvis alleller er defineret på DNA-niveau og som identificeres ved DNA-analyse.
DNA-markører
inddeles i to grupper:
1. Dem der er baseret på variation i et enkelt
basepar (SNP’er; single nucleotide polymor-phisms, SNPsogså kaldet ‘snips’), og
2. Dem der skyldes variation i antallet af nogle
på hinanden følgende gentagelser af kortere
eller længere sekvenser (VNTR’er; Variable
Number of Tandem Repeats).

Front 83

Genetisk markør

Back 83

genetisk markør et arve-ligt betinget fænotypisk træk som kan bruges til
karakterisering af et individ eller individets ar-vemasse. I snævrere forstand, og sådan som be-grebet normalt bruges, er en genetisk markør
en allel i en genetisk polymorfi der derfor også
betegnes et genetisk markørsystem.
De såkaldt klassiske markørsystemer er dem
man kunne analysere for før DNA-teknologi-ens gennembrud, hvilket i praksis vil sige ved
analyse på proteinniveau eller på enzympro-duktniveau. Det drejer sig om normalgenetiske
varianter af proteinkodende gener og omfatter
bl.a. blodtypesystemer som fx AB0-, Rhesus-og MN-systemerne (enzymproduktniveau),
samt proteinvarianter inden for vævstyper
(HLA-systemet), enzymtyper (fx sur fosfatase)
og andre proteintyper, fx serumproteiner som
haptoglobin og transferrin.

Front 84

Deletion

Back 84

Deletion: Et eller flere nukleotidpar fjernes, fx pga fejl i replikation eller i meiosens rekombination eller pga mutagene stoffer. Kaldes Del men også deficiency Df. Hvis man er homozygot (Del/Del) er det ofte dødeligt da mange gener er essentielle for overlevelse. Deletion heterozygote kan overleve deletion hvis de har vildtype allelen på den anden homologe Del/+, men kun hvis deletionen er lille. Mennesker overlever som deletion heterozygote med cri du chat (mental retardering og græder som kat).
Ekspression af gener afspejler antal af gener så ændring i gen-dose er farligt. Gende-letion kan give for lidt protein, duplikation for meget etc. Forskelligt fra gen til gen om en vildtype-allel er nok for overlevelse, normalt er det, men chancen for cancer er større, da der så kun kræves en mutation i tumorsuppressorgener. Dog: hvis det er fle-re gener på samme tid der er deleterede er det dødeligt, maks 3% deletion.
Hvis en allel har deletioner kan den ikke rekombinere med den anden homologe, se 13.4a og deletioner undertrykker derfor rekombination. Deletionsloop ses under meta-fase, fordi regionen ikke har noget at parre med.
En deletion heterozygot fungere som hemizygot for sin tilbageværende allel. (Fordi den diploide celle har halvdelen af allelerne), og udviser fænotype jf den tilbagevæ-rende allel. Hvis den normalt er recessiv vil den altså udtrykkes (ingen til at dominere) og det kaldes pseudodominans, se 13.5. Bruges til at lokalisere gener på polytene kromosomer.

Front 85

Duplikation

Back 85

Duplikation: Øger antallet af kopier af bestem DNA-sekvens (fx et eller flere gener). I tendem duplikation ligger sekvenserne så lige efter hinanden og i non-tandem (di-spersed) ligger de langt fra hinanden på samme eller et andet kromosom. Skyldes knæk eller fejl i replikation. Kaldes Dp. Har duplikationsloop under metafaseparring fordi der er flere regioner som vil parre med hinanden, se 13.8. Har sjældent stor fæ-notypisk konsekvens. Kan dog ændres pga overekspression kvantitativt eller fordi nontandem duplikation placerer genet under nu promotor. Hvis mange duplikationer, over 5% er dødeligt.
Unequal rekombination: et invivid med dp/dp kan lave ulige overkrydsning i meiose 1 og får gametre med 1 dp og 3 dp, dvs her øges eller mindskes antallet af gener for næ-ste generation. Duplikation kan give store genfamilier

Front 86

Inversion

Back 86

Inversion: halvcirkel-rotation, kaldes In. Sker når DNA knækker to steder og midter-stykket roterer jf 13.11. Hvis inversion rotere centromeren kaldes den pericentrisk og uden centromer kaldes paracentrisk. Hvis knækket sker midt i et gen (intragent) øde-lægger genets funktion. Kan også flytte genet til en anden promotor og ændre ge-nekspression. Kan også flyttes til oberon så det transkriberes i væv hvor det ikke skal bruges. Ved homozygote er der ikke den store forskel. Ændrer normalt ikke fænotype, fordi begge strenge drejes og DNA altså stadig læses i samme retning.
In/+ kaldes inversion heterozygote. Under meiosen kræves et inversionsloop, se 13.12 Hvis der så sker rekombinaion i loopet er der flere muligheder: hvis pericentrisk se 13.13a, to normale og to rekombinante, hver med duplication og deletion af en region. Zygoten af de rekombinante vil oftest dø pga genetisk ubalance.
Hvis paracentrisk se 13.13b vil de to normale være forbundet til hinanden via den ene rekombinante, som har modtaget begge centromere (den dicentriske), den acentriske er den rekombinante uden centromere. Den acentriske kan ikke allignes i metafasen og kommer ikke til nogen gamet (den mistes). Den dicentriske rykkes derimod i fra begge sider i anafase A så den knækker et tilfældigt sted. Ved fertilization er zygoten genetisk ubalanceret og vil oftest dø.
Man laver inversions med vilje for at undgå zygoter (afkom) som er rekombinante, kaldes balancer kromosomer. Ligeså er der i evolutoinen udviklet cross-over supres-sorer så vigtige genkombinationer holdes sammen

Front 87

Translokation

Back 87

Translokation: En del af et kromosom bindes til et non-homologt kromosom, kan også være to non-homologe der bytter dele (kaldes reciprok translokation) Robertsonisk translokation: reciprok translokation, hvor knækket sker nær centromeren af to acro-centriske (telocentrisk=) non-homologe, se 13.16. Giver et langt og et kort metacen-trisk kromosom, det lille mistes. I translokation ændres genekspressionen kun hvis knækkene sker intragent eller flytter til anderledes promotor. Cancer translokerer pro-toonkogener til ny promotor og giver hyperaktive onkogener som fremmer celleproli-feration. Ved homozygote er der ellers ikke den store forskel og de parrer fint i meio-sen.
Reciprok? translokation heterozygote skal i metafasen parre sig 4 sammen for rigtig segression, i kryds. Hvad med nonreciprok? Ved segregation skal n1+n2 og t1+t2 i samme gamet for overlevelse ved befrugtning, de andre overlever ikke pga genetisk ubalance. Kaldes semisterilitet fordi kun knap halvdelen af afkom kan overleve. Translokations Downs syndrom (se 13.19, hvordans er kromosom 14 og 21 ud på P?), ikke nødvendigt med helt tripelt kromosom 21 for retardering. Pseudolinkage ap og AP sammen vil sige her er afvigelse fra uafhængig nedarvning; vi får ingen aP eller Ap, så de opfører sig som koblede gener, selvom de er på forskellige kromosomer.

Front 88

Transposition

Back 88

Transposition: når et DNA-segment flytter sig selv til ny plads i genomet. Ikke synlige cytologisk. DNA-segmenterne, som har udviklet denne evne kaldes transposable elementer, transposons Tes. De koder normalt kun for noget der vedrører dem selv, dvs deres egoistiske flytten rundt. Pattedyr har hovedsageligt LINEs og SINEs (lange og korte segmenter), 20.000 kopier af LINE (særligt L1) og 300.000 kopier af SINE, hovedsageligt Alu, se 13.22a. De er begge retroposons. Bananfluen har p-element.
-Retroposoner flytter via revers transkribtion af et RNA intermediær. De er altså DNA som koder for en revers transkribtase, der kan lave RNA til cDNA og videre til dobbeltstrenget DNA, pga RNA-intermediet kan de altså kopierer sig til ny steder i genomet og øges i antal. Kan ende i Poly-A-hale eller LTR (long terminal repeats) sidstnævnte er ligesom retrovirus. Retrovirus udvikledes fra retroposons, se 13.23
-Transposons flytter DNA direkte (Nogle kalder bare TEs for transposons, men det er ikke helt rigtigt, for TEs kan også være retroposons)). Ender i inverted repeats, se 13.24. Når det flyttes repareres DNA-strengen ved at bruge søsterkromatid (kopierer transposon) eller homolog kromsom (klipper transposon). Koder for transpoase-enzymer som fremmer transposition
Når man flytter TEs skades de ofte eller deleteres, hvis de skal have hjælp til at flyttes kaldes de non-autonome elementer og de uskadede er så autonome.
Mange mutationer skyldes at TEs indsættes i eller ved et gen. Effekt afhænger af om TEs indsættes i exon eller intron, eller i grænsen så de påvirker splejsing eller i en promotor så de påvirker ekspression eller har stopcodon. Nogle TEs har foretrukne target-steder.
Transposition kan medføre deletion og duplikation i nærliggende område, fx ved une-qual croosover som på 13.26
Effekt: 1. Kan mutere genet, og hvis TE fjernes igen kommer man tilbage til vildtype. 2. Kan direkte og indirekte give kromosomal rearrangering. 3. To ens TEs kan flyttes sammen med mellemliggende gen, 13.26b. Se 465 for oversigt over anvendelse i evo-lutionen.

Front 89

Non-disjunction

Back 89

Non-disjunction betyder manglende
adskillelse af homologe kromosomer i
meiosen

Front 90

Ændring i kromosomtal

Back 90

Ændringer i kromosomtal:
I mennesker, ærter, fluer etc er 2n det normale diploide kromosomtal og n er det nor-male for haploide gametre.
-Aneuploidi: Hvis man der er tale om en afvigelse i antal af ét kromosom. Deles i monosomi (2n-1 krososom), trisomi (2n+1 kromosomer) og tetrasomi (2n+2 kromo-somer). Autosomal aneuplodi er skadeligt pga genetisk ubalance. Mennesker kan overleve monosomi og trisomi X og trisomi 21(et af de mindste kromosomer, 1,5% genom). Trisomi 18 giver Edwards syndrom og trisomi 13 giver Pataus syndrom. Aneuplodi af X-kromosomet (XO, XXY, XXX) tolereres lettere pga X-kromosom inaktivering (men den er ikke 100% effektiv), se 13.27. Det modsatte er reaktivering og det sker i kønslinie-cellerne oogonia for at sikre at hvert ovum modtager et aktivt X-kromosom.
Aneuploidi skyldes nondisjunction i meiosen. Forskelligt udfald afhængig i non-disjunction i meiose I eller II, se 13.28, Vigtig! (NB i meoise I kan man ikke dele i 3+1!). n+1 gametre giver trisomi. 0 gametre giver monosomi. Hvis nondisjunction sker i meiose I i en heterozygot diploid celle giver det heterozygote haploide n+1 gametre, men hvis den sker i meiose II giver det homozygote haploide n+1 gametre (uden rekombination). Downs syndrom skyldes ofte manglende rekombination –da chismata holder bivalenter (to søsterkromatider) sammen. 90% mor og 75% meiose I.
Trisomisk forælder medfører 50% trisomisk børn, monosomisk -> 50% monosomisk.
-Mitoisk nondisjunction: fejl i anafase A. Giver en trisomisk og en monosomisk celle. Kan også helt miste et kromosom og få en diploid og en monosomisk. Ved tidlig fejl kan man få stor klon af aneuploide celler -> Giver mosaik i væv, se 13.29. Gy-nandromorf har kvindelige og mandlige celler i mosaik.

Euploidi: S 443: euploide individer har hele kromosom sæt. Diploide har 2x altså to homologe af hvert kromosom lige som mennesker og dyr. Nogle er monoploidi og har altså kun x homologe af hvert kromosom.
Polyploidi gælder altså det normale antal kromosomer på en gang. Triploidi 3x og tetraploidi 4x. Behøver ikke betyde at x=n for hvede med 42 kromosomer, x=7 slags med 6 af hver laver gametre med n=21 kromosomer. Monoploidi og polyplodi er sjældent ved dyr. Guldfisk er tetraploide. Triploide er næsten altid sterile fordi det replikerede DNA er på 6 kromosomer som skal deles i 4 datterceller. Giver x eller 2x og det er ineffektivt.
Autopolyploider (kromosomer fra én art), allopolyploider (kromosomer fra flere arter).
CGH: comparative genomic hybridization, se 13.35, kan detektere aneuplodi, du-plikationer eller deletioner med til 50 kb

Front 91

Transposable elementer

Back 91

Transposable elementer
• Transposable elementer er DNA segmenter som kan flytte/kopiere sig fra et sted
til et andet i genomet (selfish DNA).
• To typer
– Retroposoner flytter via RNA intermediær
– Transposoner flytter DNA direkte (koder for Transposase)
• Findes hos alle organismer
• Størrelse 50 – 10,000 bp
• LINEs (Retroposoner) , Long Interspersed NucleotideElement hos pattedyr
– ~ 20,000 kopier hos mennesket (6.4kb)
• SINEs (Retroposoner) , Short Interspersed Nucleotide Elements hos pattedyr
– ~ 300,000 kopier i det humane genom
• ~ 7% af pattedyrgenomet er LINEs og SINEs

Front 92

Vide hvordan selektion kan ændre
allel-frekvenser

Back 92

• Mutationer
– Nye unikke alleler
– Ændret frekvens (gentagen mutation)
• Selektion
– Øger frekvens af favorable allel systematisk
– Naturlig (afhænger af ”fitness”)
– Menneske bestemt (avl)
• Migration
– Import (nye alleler og ændret frekvens)
– Eksport (ændret frekvens)
• Genetisk drift
– Ændret frekvens og evt tab af alleler (tilfældig retning)
– Især i små, indavlede populationer

Front 93

Betydning af mutationer i populationsgenetik

Back 93

• Afhænger af frekvens og effekt
• Ingen eller lille betydning på kort sigt
–Enkelt dyr uden betydning i stor population
• Frekvens af gunstig mutation kan øges over tid ved selektion
–Især vha moderne reproduktions- og avlsteknikker
• Ugunstige mutationer
–Holdes nede vha (naturlig) selektion; især når
mutationen er meget ugunstig, ikke recessiv og ikke
koblet til favorable gener

Front 94

Identisk homozygoti

Back 94

• Identisk homozygoti opstår når
-den samme allel fra en fælles ane nedarves til 2 beslægtede
individer
-de 2 beslægtede individer får afkom sammen
-afkommet arver den samme (identiske) alle både framor og far
Sådanne alleler er ”Identical By Descent” (IBD)

Front 95

Indavlskoefficient

Back 95

• Indavlskoefficienten ”F” (≈ indavlsgraden):
Sandsynligheden for identisk homozygoti på et giventlokus
eller
Sandsynligheden for at begge alleler i et lokus er identiske og stammer
fra forældrenes fælles ane
Mellem 0 og 1

Front 96

Slægtskabskoefficient

Back 96

• Slægtskabskoefficienten ”a” (≈ slægtskabsgraden):
Andelen af identiske alleler fra den (de) fælles ane(r) hos de to
beslægtede individer
Mellem 0 og 1
• F = ½ x a
(forældre)

• Slægtskabskoefficienten a beregnes ved at:
Identificere fælles ane(r)
Gå alle mulige veje fra den ene forældre til den anden gennem en
fælles ane
I hver vej tælles generationer (=n)
a = Σ(½)^n

Front 97

Pilediagram

Back 97

Pilediagram:
• Omfatter kun individer af betydning for indavlen
• Lettere at overskue ved beregning af slægtskab
• Hver generation angives med en pil