Veterinær Infektionsmikrobiologi

Front 1

Slægtskriterier (primære tests):

Back 1

• Form

• Farve (Gram)

• Bevægelighed (flageller)

• Sporer

• Katalase

• CytochromOxydase C

• Aerob/Anaerob vækst

• Co2 krævende

• Oxidativ/fermentativ glukoseomsætning

• Vækst på McConkey agar (galde resistens)

• Vækst ved 37 °C

• Nitrat reduktion

Front 2

Kolonimorfologi:

Back 2

Kolonidiameter: pinpoint, lille, mellemstor, stor

Profil: lavkonveks, konvenks, flad, navle, top

Rand: helrandet, uregelmæssig, filamentøs

Overflade: glat, mucoid, mat

Farve: grå, hvid, gul, rød, grøn

Hæmolyse: alfa, beta, delta, dobbelt m.v.

Front 3

Hæmolyse:

Back 3

Bakterier generelt:

- Komplet hæmolyse = Beta-hæmolyse

- Inkomplet/grønfarvning = Alfa-hæmolyse

Staphylococcus:

- Komplet, bred hæmolyse = Alfa-hæmolyse

- Komplet, smal hæmolyse = Delta-hæmolyse

- Inkoomplet hæmolyse = Beta-hæmolyse

- Dobbelt hæmolyse, hvor den yderste hæmolyse er inkomplet = Beta-delta-hæmolyse

Front 4

Gram-farvning:

Back 4

En måde at opdele bakterier i to grupper.

Hvordan bakterier lader sig indfarve med et violet farvestof: metylviolet. De Gram-positive bakterier har ikke nogen ydre membran. Denne forskel betyder, at bakterierne antager forskellig farve ved Gram-farvning

Gram-positive: blå/lilla

Gram-negative: røde

Ved gramfarvning kan man også se, om der er tale om en kok eller en stav

OBS! Mykoplasmer hører ikke ind under denne inddeling

Front 5

KOH:

Back 5

En anden måde at teste for gram-pos eller gram-neg:

En dråbe 3% kaliumhydroxid tilsættes kolonimasse på et objektglas

Slimdannelse = gram-negativ

Fx E. coli

Front 6

MOT:

Back 6

Motilitet kan testes direkte i mikroskop, eller i halvflydende medie, hvor man stikker en podepind halvt ned i et rør og inkuberer.

Herefter kan man se om bakteriemassen har bevæget sig væk fra stikket (har flageller).

Fx Vibrio

NB! Yersinia og Listeria er kun motile ved 25 C

Det er desuden sjældent at kokker er motile!

Front 7

Endosporer:

Back 7

Det er kun Clostridium- og Bacillusarter der udvikler sporer

Endosporer kan ses ved mikroskopi, og gøres ofte lettere at se ved fasekontraktmikroskopi eller nigrosin-farvning (bakterierne farves ikke, men fremtræder lyse på sort baggrund)

Front 8

Katalase:

Back 8

Om bakterien har enzymet katalase og kan spalte hydrogenperoxid (brintoverilte) til hydrogen og oxygen

Der tilsættes hydrogenperoxid til prøven

Positiv: der dannes ilt (bobler) --> de fleste gram-neg bakterier

Negativ: der dannes ikke ilt fx Streptococcer

Front 9

Cytochromoxidase:

Back 9

Cytochrom C er en del af elektrontransportkæden hos bakterien. En dråbe reagens indeholdende TMPD tilsættes filterpapir og kolonimasse tilføjes. TMPD virker som en kunstig elektrondonor for enzymet oxidase. Den oxiderede reagens danner det farvede stof indophenol blå

Positiv: blå/lilla farvning (oxiderer cyt C) fx Bacillus anthracis

Negativ: ingen farvning (reducerer cyt C)

Front 10

VLHF:

Back 10

VL-halvflydende medie til detektion af vækst

Vækst i overflade: aerob fx Pseudomonas Aeruginosa og Rhodococcus equi

Vækst i bund: anaerob fx Fusobacterium

Vækst i hele prøven: fakultativ fx E. coli

Hvis prøven bliver rød/lyserød i toppen, er det fordi den reagerer med ilt

Front 11

Candle jar:

Back 11

Også kaldet CO2 dyrkning. Mange bakterier vokser bedre med forøget CO2 koncentration = capnofile bakterier (i stedet for atmosfærens 0,3 %)

Podede agarplader sættes i lukket beholder, hvor der tændes et stearinlys, hvormed ilt-forholdende bliver således:

10-15% ilt, 5% CO2

Fx Campylobacter

Front 12

O/F:

Back 12

Test om bakterien nedbryder glucose oxidativt eller fermentativt

Gul farve i bund eller hele røret: fermentativ (danner meget syre) fx Enterobacteriaceae

Gul farve i toppen: oxidativ (danner lidt syre) fx Micrococcus

Grøn/blå: ikke podet eller negativ (kan ikke nedbryde glucose) fx Moraxella

Front 13

Nitratreduktion:

Back 13

Nit 1 og nit 2 tilsættes prøven:

Rød farve: nitrat er reduceret til nitrit (=positiv)

Klar farve: negativ ELLER nitrit er reduceret videre (=positiv)

Dette kan klargøres ved at tilsættes zink: hvis farven nu bliver rød, er det nitrat i prøven og IKKE nitrit (=negativ). Hvis prøven forbliver klar, har der været nitratreduktion (=positiv).

Positiv: fx Clostridium perfringens

Negativ: fx Fusobacterium

Front 14

NA agar:

Back 14

Nutrient agar

Kan bakterien vokse uden specifikke vækstfaktorer (blod, serum)

Fx Staph Aureus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium

Front 15

MacConkey agar:

Back 15

Både selektiv og indikativ medie:

Selektiv: indeholder galdesalte og krystalviolet, som hæmmer de fleste gram-pos

Vækst, men ingen rødfarvning fx Salmonella

Indikativ: rødfarvning ved fermentering af laktose (koliforme bakterier) fx E. coli

Front 16

Mannitol saltagar:

Back 16

Høj saltkoncentration (7,5 %)

Både selektiv og indikativ medie

Selektivt: kun staphylococcer kan vokse, til trods for saltkoncentrationen

Indikativt: Mannitol-fermentering (gulfarvning)

fx Staph. Aureus

Front 17

Æsculin-blodagar:

Back 17

Æsculin (fluorescerende) hydrolyseres til æsculitin -> æsculitin danner kompleks med jern

Sort/mørkfarvning: bakterien kan hydrolysere æsculin: der ses en jernudfældning. Ingen fluorescerende effekt

Fx Klebisella (99%) og E. coli (35%)

Front 18

Sulfit jern-agar:

Back 18

Sulfitreduktion: sultif til hydrogensulfid (hydrogensulfid danner kompleks med jern)

Na2S2O3 → H2SH2S + Fe++ → FeS

Sortfarvning i stik: positiv (sulfitreducerende)

Fx Clostridium sporogenes

Front 19

Æggeblomme-agar:

Back 19

Om bakterien kan fraspalte fedtsyrer (lecitinase)

Hvid zone omkring koloni: positiv

Fx Bacillus cereus

Front 20

BLSF agar:

Back 20

= Brilliantgrøn laktose sakkarose phenolrødt

Brilliantgrønt hæmmer de fleste gram-pos

Gult farveskift = fermentering af laktose og/eller sakkarose

Kan anvendes sammen med MacConkey agar, for at afgøre om bakterien KUN kan fermentere laktose

Front 21

ONPG:

Back 21

ONPG (analog til laktose) (orto-Nitrophenyl-beta-D-Galactopyranosid) spaltestil en gulfarvet nitrophenol af enzymet beta-galactosidase (lactase)

Gul: positiv (har beta-galactosidase aktivitet (kan fermentere ONPG) fx Staph. pseudointermedius

Klar: negativ (kan ikke fermentere ONPG)

Front 22

Koagulase-test:

Back 22

Rør med citratstabiliseret plasma (fx fra hest eller kanin) podes og inkuberes, hvorefter der undersøges for koagulation

Positiv: kun staphylococcer (subsp. varierer efter typen af serum)

Front 23

CAMP-faktor:

Back 23

Om bakterien laver forstærket eller hæmmet hæmolyse: lyserer blod, når erythrocyterne er påvirket af beta-hæmolyse fra Staph. Aureus

Fx Listeria monocytogenes

Front 24

Loeffler serum (skråserum):

Back 24

Om bakterien kan nedbryde serum (proteinaser)

"Huller" i skråserum: positiv fx Trueperella pyogenes

Komplet skråserum: negativ

Front 25

Indol:

Back 25

Tryptofan --> (tryptofanase) --> fraspalter alanin-sidekæden fra tryptophan og danner indol

Rød i toppen: positiv fx E. coli

Gul i toppen: negativ

Front 26

Methylrødt (MR):

Back 26

pH indikator, som oftest anvendes til differentiering mellem Enterobacteriaceae. Tilsætning af methylrødt til prøve:

Rød: positiv (mixed acid pathways) fx Salmonella, E. coli og Yersinia

Gul: negativ

Front 27

Vogues Proskauer (VP):

Back 27

Detekterer acetoin (butandiol fermentation)

Bruges ofte til at differentiere Bacillus-arter

Rød/pink: positiv

Gul/brun: negativ fx Bacillussphaericus

Front 28

TSI-agar (tre-sukker-jern):

Back 28

Anvendes ofte til differentiering mellem Enterobacteriaceae.

Tester sukkerfermentering (glucose, laktose og sukrose):

Pink overfalde, gul bund: glucose-fermenterende fx Salmonella

Gul overflade, gul bund: laktose og/eller sukrose (+ glucose) fermenterende fx E. coli

Orange: upodet/negativ

Tester desuden for:

-Thiosulfat reduktion --> H2S (sortfarvning i stik) fx Salmonella og Erysipelothrix

-Anaerob + aerob zone: om der dannes gas

+ gas: fx E. coli

- gas: fx Yersinia

Front 29

Durham-rør:

Back 29

Dannelse af CO2 og H2, som ses ved små glas med bunden opad i podede rør

Hvis bakterien danner gas ved fermentering, ses luft i disse glas

Fx Proteus Mirabilis

Front 30

Urinstof:

Back 30

Urea omdannes til CO2 og ammoniak (urease) -> stigning i pH

Pink/lilla: positiv fx Klebsiella pneumoniae

Orange: upodet

Gul: negativ

Front 31

Simmons citrat:

Back 31

Minimalmedium, hvor citrat er eneste kulstofkilde og ammonium er eneste kvælstofkilde

Blå: positiv (vækst) fx Proteus mirabillis og Salmonella

Grøn: upodet/negativ

Front 32

Syrefasthed:

Back 32

Bakterier, som ikke kan affarves med syre

Kun mycobacterium

Front 33

V-faktor (NAD) behov:

Back 33

Nogle bakterier kan ikke selv syntetisere NAD (V-faktor) og er afhængig af at en anden bakterie (eller værten) leverer denne vigtige co-faktor

Fx Actinobacillus pleuropneumoniae

Man kan dyrke bakterien på chokoladeagar (lyseret blod agar), eller man kan påsætte tabletter indeholdende NAD på agarpladen

Man kan desuden dyrke en "ammekultur" = en bakterie, der kan danne NAD, fx Acinetobacter, E. coli og Staphylococcer. Her vil der ses satellitvækst, af den bakterie med V-faktor-behovet (vokser kun tæt på ammekulturen)

Front 34

Sabouraud agar:

Back 34

Selekterer for svampe: medium med lav pH og forholdsvis høj koncentration af sukker.

Består af:

1% peptone

4% glucose

1,8% agar

pH 5,5

Eller pH 7 og tilsat chloramphenicol 25 μg/ml

OBS! Længere inkubationstid (svamper er langsommere om at vokse) 1-2 uger

Fx Aspergillus, Candida, Malasezzia

Front 35

Lactophenol cotton blue:

Back 35

Farvning som bruges til svampe

Phenol dræber svampen, cotton blue farver svampens cellevæg

Kan også bruges til alger!

Front 36

PCR:

Back 36

En gen-opformeringsteknik, hvor man opkopierer (fordobler) bestemte DNA-sekvenser i en række gentagne cyklusser.

1. Opvarmning medfører denaturering af DNA

2. DNA-polymerase kan kun kopiere DNA, hvis der er korte primer-sekvenser af komplementær-DNA til rådighed (der skal bruges to forskellige primere - én til start af kopiering i hver retning). Primerne binder til DNA'et der, hvor kopieringen skal begynde, under nedkøling

3. Elongering (dannelse af de nye, komplementære DNA-strenge)

Efter opformering, kan man tilsætte DNA'et til en brønd i en gelelektroforese, som viser størrelsen på genet (bp), ved at sammenligne med en kontrolbrønd med kendte genstykker

Front 37

Sekventering af DNA:

Back 37

Kortlægningen af den nøjagtige DNA-sekvens, altså rækkefølgen af nukleotiderne A, T, C og G

DNA-sekventeringen foregår ved en særlig kopiering af DNA'et, hvor de brugte byggesten (nukleotiderne) bærer en fluorescerende gruppe. I aflæsningsresultatet er hver farveplet et område, hvor en gruppe af ens DNA-strenge sekventeres. Ved brug af farvekoderne, kan sekvenserne derfor afkodes.

Front 38

Maldi-tof:

Back 38

= matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight

Ved denne metode sammenlignes proteinsammensætningeni en koloni, med proteinsammensætningen i flere tusinde referencestammertilhørende forskellige species.

En metalplade tilsættes en LILLE mængde kolonimasse og 1 µl CHCA matrix

Pladen kører ind i et spektrometer, der måler sammenhængen imellem proteinernesstørrelse og "flyvetid", samt deres forskelligespektre. Metalpladenkan tage 96 prøverad gangen.

Front 39

API 20E:

Back 39

Et standardiseret identifikationssystem for enterobacteriaceae:

En plastikbakke med kamre, der indeholder 20 miniature biokemiske tests

De fleste kamre tilsættes blot kolonimasse blandet med sterilt, destilleret vand, og aflæses efter inkubation.

Andre skal tilsættes yderligere reagenser efter inkubation, inden aflæsning