Meta Sys

Front 1

1) Definieren Sie die Begriffe „Metabolic fingerprinting“ und „Metabolic footprinting“!

Back 1

Metabolic fingerprinting:
Behandelt die intrazellulären Metabolite
Metabolic Footprinting:
Behandelt die extrazellulären Metabolite

Front 2

2) Definieren sie die Begriffe „Metabolomics“ und „Metabonomics“

Back 2

Metabonomics:
Die Untersuchung der dynamischen multiparametrischen metabolischen Antwort von lebenden Systemen auf pathophysiologische Stimuli oder genetische Modifikationen (Infos über Disfunktionen des Metabolismus ausgelöst durch Umwelteinflüsse)
Was haben Umwelteinflüsse für Auswirkungen?
Metabolomics:
Untersuchung des Basisstoffwechsels von Bakterien
Einfluss von Umweltfaktoren auf die Physiologie von Bakterien
Host-Pathogen-Interaktion Untersuchungen
Analyse symbiotischer Lebensgemeinschaften
Charakterisierung unbekannter Metabolite

Front 3

3) Bis zu welcher Molekülgröße wird i.A. von einem Stoffwechsel-Metabolit gesprochen?

Back 3

Stoffe, die kleiner als 1500 Da (g/mol) sind

Front 4

4) Welche Grundsätzlichen Unterschiede sind bei der Analyse von Metaboliten im Gegensatz zu Proteinen bzw. DNA oder mRNA zu erwarten?

Back 4

Viele unterschiedliche Substanzklasse und Probleme bei Trennung von makromolekülen, da gegebenenfalls Metabolite verloren gehen. Keine Informationen beruhend auf dem genetischen Code, da es verstoffwechselt wird.

Front 5

5) Nennen Sie vier Mögliche Einsatzfelder der Metabolomics!

Back 5

Medizin:
(Untersuchung von Körperflüssigkeiten oder Gewebeproben)
Lebensmittelchemie:
(Analytik)
Zellkulturen und Bakterien:
(Krankheitserreger Charakterisierung, Suche nach neuen Biomarkern, Biotechnologie, neue Kenntnisse der (Patho)physiologie, Untersuchung von Arzneistoff Wirkung)
Pflanzen, Pilze etc.

Front 6

6) Welche Anwendungen sind in der mikrobiellen Metabolomics derzeit Aktuell (3 Beispiele)?

Back 6

Klassifizierung Mycobakterien für die Gabe fokussierter Antibiotika (Paper)
Staphylokokken Metabolismus unter Stresssituationen (Paper)
Entwicklung von Analysemethoden für die Untersuchung von Metabolom (Paper)

Front 7

7) Welche bioanalytischen Methoden kennen Sie in der Metabolomics?

Back 7

GC
GC-MS
HPLC HPLC/MS
LC-MS
NMR

Front 8

8) Welche Vorteile haben Methoden der Massenspektroskopie gekoppelt an Chromatographie in der Metabolomics?

Back 8

Niedriges Detektionslimit
GC-MS: Trennung flüchtiger Derivate, kleine Moleküle
LC-MS: größere Moleküle, phosphorylierte Moleküle
Automatisiert
10 - 100 Metabolite gleichzeitig untersuchbar

Front 9

9) Welche Vorteile bietet die NMR-Spektroskopie in der Metabolomics gegenüber der HPLC-MS bzw. GC-MS?

Back 9

Interner Standard - direkte Quantifizierung mit TSP
Proben wiederverwendbar
Wässrige proben (keine Lyophilsation)
Kurze Messzeiten ~ 10 min
Zerstörungsfrei, Probe nach Analyse weiter verwendbar

Front 10

10) Welche prinzipiellen Nachteile haben NMR-spektroskopische Untersuchungen in der Metabolomics?

Back 10

Geringes Detektionslimit, unempfindliche Methode
Keine Trennung von Molekülen

Front 11

11) Nennen Sie 3 wesentliche Parameter, die das Ergebnis einer Metabolom-Analyse in der NMR-Spektroskopie beeinflussen

Back 11

pH-Wert, Salzgehalt und Temperatur

Front 12

12) Nennen Sie 3 Methoden der NMR-Spektroskopie, die in der Metabolomics häufig eingesetzt werden!

Back 12

COSY
JRES
HSQC

Front 13

13) Was kann man aus einem JRES-NMR-Spektrum ablesen und welche Vorteile bietet diese Art der 1H-NMR-Spektroskopie?

Back 13

2D-NMR
Auftragung von chemischer Verschiebung und spin-spin-Kopplung (Kopplungs-Konstante)
Verbesserte Auflösung und Identifikation von Metaboliten
Hertz (Kopplungskonstante) und ppm (chemische Verschiebung)

Front 14

14) Erläutern Sie kurz, wie die Quantifizierung in der NMR-Spektroskopie erfolgt?

Back 14

Integral des NMR-Signals proportional zur Konzentration
Identifizierung der Signale, für Integration ein intensives Signal nötig
Berechnung der Massenverhältnisse der Verbindungen aus Signalintensität
Vergleich der Intensität mit internen Standard

Front 15

15) Welche Methoden der HPLC-MS werden in der Metabolomics eingesetzt?

Back 15

Normalphasen HPLC (Silicagel; SiO 2 )
Reversed‐Phase HPLC (Silicagel; C18; C8; CN…)
HILIC (Hydrophilic Interaction) mit RP‐Material oder Normalphasen‐HPLC‐Material
Ionenpaar HPLC (RP-Material mit speziellen mobilen Phasen)

Front 16

16) Welche massenspektrometrischen Analysatoren kommen in der Metabolomics zum Einsatz (3 Beispiele)?

Back 16

TOF
ICR (Ionen Cyclotron Resonanzzelle)
QIT
Quadropol-Massenfilter
doppelt fokussierendes Sektorfeld
Orbitrap

Front 17

17) Was beschreibt der KOVATS- Index? Welche Bedeutung hat dieser Index in der Metabolomics?

Back 17

Wiki:
Ermöglicht eine geräteunabhängige Normierung der Retentionszeiten in der Gaschromatographie. Dadurch wird es möglich, auch Daten anderer Laboratorien zur Substanzidentifizierung heranzuziehen.
Der Kovats-Index nutzt die Beziehung zwischen Kohlenstoffgehalt und Retentionszeit einer Substanz in einem gaschromatographischen System, um einen geräteunabhängigen Wert zur Identifikation unbekannter Substanzen zu erhalten

Front 18

18) Beschreiben Sie die prinzipielle Vorgehensweise bei der GC-MS-Analyse von intrazellulären Metabolomanalysen!

Back 18

1. Vorbereitung
a. Zellen kultivieren
b. Zellen abtrennen und Metabolismus quenchen
c. Zellen aufschließen
c. Metabolite abtrennen (polare/unpolare Extraktion)
d. Derivatisierung
2. GC
a. Injektion
b. Verdampfung
c. Trennung über Säule
3. MS
a. Ionisation/Zerstückelung
b. Detektion

Front 19

19) Warum müssen der GC/MS häufig Metabolite und deren Gemische derivatisiert werden?

Back 19

GC:
Verdampfung der Analyten möglich
schwer verdampfbare Metabolite und deren Gemische können durch Dervivatisierung in leichter Verdampfbare, flüchtigere umgewandelt werden. Außerdem sind diese thermisch stabiler.
Vorgehen:
Umwandlung von Polaren in weniger polare Verbindungen
Beispiele:
Methylierung
Silylierung

Front 20

20) Welche Derivatisierungsreagenzien kennen Sie?

Back 20

Trimethylchlorsilan (TMCS)

N,O-bis-(trimethylsilyl)acetamid (BSA)

Diazomethan

MeOx (Methoxamin)

MSTFA

Front 21

21) Schreiben sie die Reaktionsgleichung für die Derivatisierung von Serin mittels MSTFA und MEOX auf!

Front 22

22) Welche Alternative gibt es zur Derivatisierung mittels Heizblockmethode?

Back 22

Neben der Standard-Derivatisierungsmethode im Heizblock (HB) gibt es die mikrowellen-basierte Derivatisierungsmethode (MW).

Front 23

23) Warum kann unter Umständen für einen Stoffwechselmetaboliten auch mehr als ein chromatographisches Signal in der GC-MS detektiert werden?

Back 23

Vollständige und unvollständige Derivatisierung.
Bestimmt Extraktionsmittel können Umsetzung der Metabolite hervorrufen, zB Glutamat kann auch 5-Oxo-prolin

Front 24

24) Beschreiben Sie kurz, was man unter der HILIC-Chromatographie versteht!

Back 24

HPLC Methode, welche auf Hydrophilic Interaction (HILIC) beruht. Sie wird in der Arzneistoff-Analyse verwendet, ist aber nicht gut reproduzierbar. Polare stationäre Phase mit wässrigem Laufmittel.
Verwendet wird eine polare stationäre Phase und ein wässriges Puffersystem mit organischen Modifier, bevorzugt Aconitril. Wasser stellt hierbei das stärkste Elutionsmittel dar. Gradienten beginnen mit hohen Aconitril-Anteil (>70%) und enden mit hohen Wasser/Puffer-Anteil in der mobilen Phase.
Die Trennung geschieht lediglich über die polare, funktionelle Gruppe und nicht nach molekularer Masse.

Front 25

25) Welche Metabolite können gut mittels HILIC-Chromatographie analysiert werden?

Back 25

Sie stellt eine Möglichkeit der Trennung hoch polarer Stoffe dar. Sie wird in der Arzneistoff-Analyse verwendet.

Front 26

26) In der Metabolomics wird in der HPLC-MS u. a. auf Ionenpaar-Reagenzien zurückgegriffen. Warum wird diese Methodik angewandt, und welche Vorteile bzw. Nachteile gibt es dabei?

Back 26

hplc-saule.de:
Zur Trennung der Analyt-Ionen wird der mobilen Phase zusätzlich ein entgegengesetzt geladenes Ionenpaarreagenz zugegeben. Dieses geht mit den Analyt-Ionen eine ionische Bindung ein und weist zudem einen stark hydrophoben Charakter auf. Die so gebildeten, ungeladenen Moleküle können dann regulär nach dem Prinzip der Reversed Phase-Chromatographie getrennt werden.
Vorlesung:
Methode zur quasi-RP-HPLC sehr polarer Verbindungen. Pro Ladung wird ein Molekül Ammoniumsalz (Tributylamin) hinzugegeben, welches kompatibel mit der C18-RP-Phase ist.
Vor- und Nachteile:
Umso höher die Ladung, desto später eluieren die Metabolite in der IP-HPLC
Problem: Kontamination des Massenspektrometers mit IP-Reagenz.

Front 27

28) Welche Paramter müssen bei der Entwicklung eines Aufschlussprotokolls für die Analyse intrazellulärer Metabolite beachtet werden? (4 Beispiele)

Back 27

1) Extraktionslösung darf Metabolite nicht verändern, und muss eine große Zahl an Metaboliten effizient extrahieren
2) Zellabtrennung muss schnell gehen, ohne dass der Energy-Charge verändert wird
3) Quenching--> mit organischen LM oder mit flüssig N2
4) welche Aufschlussmethode? → so schnell wie möglich, vorsichtig und effektiv

Front 28

29) Gram-positive und Gram negative unterscheiden sich hinsichtlich des Aufbaus ihrer Zellwand. Nennen Sie drei Unterschiede. Welchen Einfluss hat der Aufbau der Zellwand auf die intrazelluläre Metabolomanalyse?

Back 28

Gram-Positiv: Dicke, mehrschichtige Murein-Schicht, Gram negativ: dünne Murein Schicht
Gram-positiv: Keine Outer-membrane, gram-negative. Outer-membrane
Unterschiedliche Peptid-Linker zwischen den Saccharid-Strängen des Mureins
Einfluss: Die Aufschlussmethode muss an die Zellwand angepasst werden, da diese mglw. unterschiedlich effektiv aufgeschlossen werden können

Front 29

30) Was versteht man unter dem Energy-Charge, und warum ist dieser Wert in der Methodenentwicklung für die intrazellulären Metabolomanalysen häufig untersucht?

Back 29

Es ist eine Maßzahl für den Energiezustand einer Zelle und beschreibt das Verhältnis aller Adenosylnukleotide in der Zelle. Für die Metabolomanalysen stellt der Energy-Charge ein Parameter dar, der Aufschluss auf die Qualität des Aufschlusses gibt. Sinkt der EC ist dies ein Hinweis auf Stress für die Zellen, was während des Aufschlusses möglichst vermieden werden soll.

Front 30

31) Schreiben Sie die Berechnungsformel für den Energycharge auf! Welchen Wertebereich kann der EC bei Bakterien haben?

Back 30

theoretisch: zwischen 0 und 1
praktisch: 0,75 und 0,95