Use LEFT and RIGHT arrow keys to navigate between flashcards;
Use UP and DOWN arrow keys to flip the card;
H to show hint;
A reads text to speech;
34 Cards in this Set
- Front
- Back
|
Ge exempel på olika fluoroforer. Vad gör de och vad är de känsliga för? |
Cy3, Cy5 De fluorescerar (vid en specifik våglängd) Mycket ljuskänsliga |
|
|
Vad är en prob? |
En kort DNA-sekvens |
|
|
Vad är hybridisering? |
"Binder till" DNA om proben är komplementär |
|
|
Vad är en direkt inmärkt prob? |
Den tillverkas genom PCR Fluoroforer kopplade till dNTP |
|
|
Vad är en indirekt inmärkt prob? |
Proben tillverkas genom PCR Kräver detektionssystem (ej kopplade direkt till dNTP) Håller bättre |
|
|
Vad är grundprincipen för FISH? |
1. Glas med metafaser från provet 2. Tillsätt proben på provet 3. Denaturera prob + prov 4. Hybridisering 5. Tvätta, färga DNA med dapi, antifade 6. Analysera med fluorescens-mikroskop |
|
|
Vilken kombination av olika prober finns? |
Centromerspecifika prober (grön) Lokus specifika prober (röd) Kombination av olika prober med olika färger |
|
|
Vad är principen för multicolor-FISH? |
Samma fluorofor på kromosomspecifika prober används för att detektera en hel kromosom |
|
|
Vilka patientprover kan användas i en FISH? |
Lymfocyter (från venblod) Amniocyter (avstötta celler från fostret; celler från andningsvägarna, urinvägarna, mag-och tarmkanalen samt huden) Korionvilli (placenta) |
|
|
Vilka cellers interfas eller interfas + metafas analyseras? |
Interfaser: majoriteten av en individs celler är differentierade till specialiserade celler, som aldrig eller sällan delar sig Interfaser + metafaser: celler som kan odlas, bland annat lymfocyter, fibroblaster, amnioceller, benmärgsceller och tumörceller |
|
|
Vad sker med proben ifall det finns en deletion i en DNA-sekvens? |
Hela eller en del av proben binder dåligt och tvättas bort, ses som att rött finns men grönt fattas |
|
|
Klinisk tillämpning för FISH? |
Trisomi Genamplifiering Kontroll vid benmärgstransplantation Prenatal fosterdiagnostik (fosterdiagnostik) Utredning för numerisk avvikelse av könskromosomer |
|
|
Hur undersöks det ifall det finns en eventuell translokation? (Var den ligger?) |
Använder lokus-specifika prober Märk in områden som ligger nära brottet för translokationen Normal: intakt röd/grön signal Translokation: delad signal |
|
|
När används FISH? |
Fall med dålig G-bandning Detektera specifika mikrodeletioner som ligger utanför upplösningen för G-bandning Identifiera extra material av okänt ursprung Upptäcka specifika kromosomarrangemang som är karakteristiska för en del cancersorter (deletioner, translokationer osv) Kromosomräkning (prenatal diagnostik + cancer) |
|
|
Hur förbereds en FISH? |
1. Cellodling; lymfocyter från perifert blod, phytohemagglutinin (stimulerar proliferation) + cellodlingmedium. Odlas i 72 h i 37 grader 2. Preparation av celler och glas med metafaser; Colcemid tillsätts Centrifugering Späd cellerna med hypokondrikern lösning Inkubation Centrifugering Späd med fixlösning Droppa på glas |
|
|
Vad gör colcemid? |
Förhindrar bildningen av kärnspolen Celldelningen stoppas i metafasen Kromosomerna är maximalt kontraherade och mest synliga |
|
|
Vad gör den hypotona lösningen? |
Vatten tas upp av cellerna = cellerna sväller Gör att kromosomerna sprider sig på större områden då de droppas på objektglas |
|
|
Hur fixeras cellerna? |
Med metanol:ättiksyra (3:1) Kromosomerna bevaras i de svullna cellerna Erytrocyterna lyseras |
|
|
Hur går det till när cellsuspensionen droppas på glas? |
Glaset förvaras i 55 grader avjoniserat vatten Cellsuspensionen droppas på ett rent objektglas då glaset hålls i 45 graders vinkel Glaset läggs därefter på en kyvett i ett vattenbad under några minuter = bättre spridning och cytoplasman penetreras |
|
|
Vilka faktorer påverkar metafas-spridningen på glasen? |
Nygjord fixeringslösning Glaset ska vara rent och fritt från smuts Celltäthet/koncentrationen Vinkeln på glaset Höjden från vilket cellsuspensionen droppas Temperatur och fuktighet |
|
|
Hur görs bedömningen av glasets kvalitet? |
Med mikroskop som har faskontrast |
|
|
Hur gör man så att ofärgade levande celler kan ses i ljusmikroskop? (Absorberar ej ljus) |
Tvingar ljuset att gå andra vägar i mikroskopet, ger optiska effekter så att man kan se preparatet Mörk bakgrund |
|
|
Hur uppnås faskontrast? |
För in en kontrastring i ljusgången Välj objektiv märkt pH, grön ring Justera skärpeljuset |
|
|
Vad bedöms i mikroskopet? |
Lagom spridda metafaser/celltäthet Tillräckligt många metafaser, jämt fördelade på glaset Ihopklumpade celler = dåligt gjord preparation Kärnan och kromosomerna ska vara mörkgrå, om det är ljusgrå eller svarta = hybridiseringen blir ej så bra Undvik cytoplasma och skräp, de påverkar hybridiseringen och ger bakgrund Lagom spridda kromosomer, ej korsade kromosomer |
|
|
Vilka fördelar medför det att åldra cellerna? |
Effektiviteten förbättras i hybridiseringen och signalstyrkan |
|
|
Hur kan man åldra cellerna? |
Naturligt (ett dygn i rumstemperatur) Artificiellt: 2XSSC, 30 min Dehydrering (70-80-95%-ig EtOH, 2 min i vardera konc.) Lufttorka i 5 minuter |
|
|
Vad görs under första delen av labben? |
Vortexa + centrifugera proben i mörker Applicera proben på det utvalda området Applicera täckglas + lim Denaturera proben och DNA på glaset, 73 grader på värmeblock Hybridisera glaset mörkt i fuktkammare, 37 grader (i box med blöt servett bakom) |
|
|
Vad görs under andra delen av labben? |
Ta bort limmet och täckglaset Tvätta glaset i en kyvett med tvättlösning = tar bort ospecifik bindning Kontrastfärgs med DAPI Applicera antifade på glaset Förvara glaset mörkt till analys |
|
|
Vad gör DAPI? |
Färgar DNAt blått |
|
|
Vad gör antifade? |
Förhindrar att proben tappar signal |
|
|
SRY-genen |
Uttrycks = manlig utveckling Uttrycks ej = kvinnlig utveckling Lokaliserad på Y-kromosomens p-arm Består av en enda exon = 204 aa protein XX + sry-genen = infertil |
|
|
Vad är pseudoautosomala regioner? |
Homologa sekvenser som möjliggör att X och Y paras ihop samt separerar under meiosen Överkorsning kan ske i dessa regioner på X och Y kromosomerna X och Y har 2 pseudoautosomala regioner; PAR1 på p-armarna och PAR2 på q-armarna (gener inom dessa nedärvs autosomalt, ej som könskromosom-bunden nedärvning) |
|
|
Var ligger SRY-genen? |
Utanför de pseudoautosomala regionerna, vilket gör att SRY normalt ej berörs av överkorsningen SRY ligger nära PAR1, ger i vissa fall rekombination = translokation där SRY ligger telomert på X |
|
|
Vad heter proben som användes? |
CEPY/CEPX |
