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42 Cards in this Set
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Wie funktioniert die Restriktion Enzym Verdauung und Ligation? |
- über Sticky End Cloning -> PCR amplifiziertes Fragment wird verdaut (REase) -> Entstehung von Sticky Ends -> Gespaltenes Fragment kann in einen Plasmid Vector ligiert werden (durch T4 DNA Ligase) |
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Vor- und Nachteile von RE/Ligation Cloning? |
Vorteile: - kostengünstig - kein Cloning Kit notwendig Nachteile: - Abhängig von der Restriktionsenzym Angriffsstelle . Zeitaufwändig |
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Was ist TOPO-Cloning? |
TOPO-Plasmide werden durch Restriktionsverdau linearisiert und anschließend kovalent mit einer Topoisomerase gekoppelt, die die Ligation eines PCR-Produkts bewirkt und daher keine Ligase mehr erfordert |
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Was ist die TA-Klonierung? |
Eine Art der TOPO Klonierung - ebenfalls literarisierte Vektoren, die einen T 3' Überhang haben |
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Was ist der Vorteil von TOPO Klonierung gegenüber RE Verdau & Ligation? Was haben beide für einen Nachteil? |
Zeitsparend -> RE: 2 Tage / TOPO: unter 1 Tag Nachteil beider Methoden: keine gezielte Orientierung des Inserts im Vektor |
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Was ist die Gateway Klonierung? |
Ein Entry Clone transferiert Gen in viele verschiedene Zielvektoren Vektoren um viele verschiedene Expressions Klone zu erhalten |
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Was ist ccdB? |
- Suicide Gen für E. coli - ccdB Protein interferiert mit DNA gyrase und hemmt somit Wachstum der meisten E. coli Arten Weil destination Vektor in Gateway Klonierung ccdB Gen enthält muss es in E. colis transformiert werden, die eine Gyrase Mutation aufzeigen |
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Was ist der Vorteil von Gateway Klonierunng? |
Extrem effiziente Konieriungsstrategie |
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Was sind Charakteristiken, die ein binärer Vektor der Gateway Klonierung haben muss? |
Left Border und Right Border und attR sides |
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Was ist die USER Klonierung? |
Uracil-Specific-Excision-Reaction - Generiert eine single Nukleotid Lücke bei Uracil - ist unabhängig von Vektortyp und Fragmentgröße |
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Was ist das Prinzip hinter der USER Klonierungstechnik? |
Generation eines 8 Nukleotid 3' Überhangs (langes Sticky End) auf dem Vektor und dem PCR Produkt um stabiles Produkt zu erhalten |
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Vorgehensweise von USER Cloning? |
1. Obstruktion eines Vektors -> Vektor wird mit PAC verdaut (schneidet Teil aus Vektor raus) 2. Generierung eines USER PCR Produkts -> benötigt 8 Nukleotid 3' Überhang und ein A an Position 8 3. Insertion des PCR Produkts in den Vektor |
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Gibson Cloning |
- erlaubt Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente unabhängig von Länge oder Enden Kompatibilität - Verbindet mehrere überlappende DNA-Fragmente in einem Tube bei isothermer Reaktion - braucht kein Uracil oder andere extra Nukletotide um Lücken zu füllen |
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Prinzip der Gibson Klonierung? |
- zu verbindende DNA-Fragmente werden durch PCR amplifiziert und mit assembly Enzymen (3 Stück) inkubiert. -> Mixtur wird in Bakterien transformiert |
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Welche 3 Assembly Enzyme für Gibson Klonierung? Was machen diese Enzyme? |
1. T5 Exonuklease -> erstellt Einzelstrang 3' Überhang für Anlagerung der Fragmente, die Komplementäre Enden tragen 2. DNA Polymerase -> füllt die Lücken in jedem Angelagertem Fragment 3. DNA Ligase füllt Löcher der entstandenen DNA |
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was sind forward und was sind Reverse Primers? |
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Genome Editing - 4 Familien von engineered Nukleasen? |
1. Zinc Finger Nukleasen (ZFNs) 2. Transkriptions Activator-like Effector Nucleases (TALENs) 3. CRISPR/Cas System 4. Honing Endonucleases |
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Was sind Zinc Finger Nukleasen? |
- künstliche Restriktionsenzyme - generiert durch Fusion einer Zinc Finger DNA-Bindungsdomäne mit einer Dna-Teilinns Domäne einer Endonuklease - kann für präzise Änderung des Genoss von höheren Organismen genutzt werden - können für bestimmte DNA-Sequenzen erstellt werden |
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Zinc Finger Nukleasen - Woher kommt die DNA Bindungsdomäne? |
von Zinc Finger Transkrisptionsfaktoren |
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An wieviele Nukleotide kann eine Zinc Finger Bindungsdomäne binden? |
an 3 Nukleotide |
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Was ist und macht FokI? |
- ist eine Typ IIS Restriktionsendonuklease - besitzt eine DNS-Bindungsdomäne (N-Terminal) und eine nicht spezifische DNA Teilungsdomäne (C-Terminal) - Bindet an spezifische Sequenz der DNA und aktiviert Teilungsdomäne, welche DNA an einem Strang 9 Nukleotide von Bindungsdomäne entfernt teilt und anderen Strang 13 Nukleotide davon entfernt teilt --> Nutzung der Teilungsdomäne in Kombination mit Zinc Finger Nukleasen |
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Was benötigt man bei ZFNs um double Stranded Breaks (DSBs) der DNA zu erzielen? |
- Zwei Kopien einer 3 Finger ZFN, die eine 9 BP lange Sequenz erkennen --> Somit hat sie eine 18 Basenpaar Erkennungssequenz -> genug um einmalig in Genomen von Pflanzen und Säugetieren vorzukommen |
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Wie werden erzeugt DSBs repariert? |
Durch zelteigene Mechanismen |
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Welche zwei Wege der DSB Reparatur gibt es? |
- Homologe Rekombination (HR) - Nicht Zoologe Rebkombination (NHEJ) |
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Was ist TALE? |
- Transcription Activator Like Effectors aus Pflanzenpathogen Xanthomonas spp. - Proteine, die in Eukaryotische Zelle durch Typ II Sekretionssystem sekretiert werden - induzieren Transkription verschiedener Gene Aufbau: - N-Terminales Typ III Sekretions Signaldomäne - zentrale Region besteht aus 10-18 sehr ähnlichen Tandem Repeats, von denen jeder r34 Aminosäuren lang ist - C-Terminale Effektor Domäne |
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TALE - Welche Position in den Tandemrepeats definiert die Bindung zu Nukleotiden? |
Position 12 und 13 |
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2 Große Klassen der künstlichen TALE Proteine |
- TALE-TFs -> Fusion mit Transkriptionsfaktordomäne VP64 welche ein Gen des Interesses aktiviert - Fusion zu einer nicht sequenzspezifischen nukleares (FokI) -> TALE Nuklease (TALENS) -> Paare einer TALEN können erstellt werden, um an spezifische DNA Sequenzen zu binden und in der Lage sind FokI Dimmer zu bilden -> Erzeugung eines DSB |
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Was sind CRISPRs und Cas? |
CRISPR: - = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - DNA Loci, welche kurze Repeats enthalten - jedes Repeat gefolgt von spacer DNA - Spacer erkennen und schneiden exogenes genetisches Material analog zu RNAi in eukaryotischen Organismen Cas: - = CRISPR Associated - Gene, die für Endonukleasen codieren - CRISPR/Cas System ist ein prokaryotisches Immunsystem, dass Resistenz gegen exogenes Material zeigen (form der erworbenen Immunität) - Durch CAs9 Protein und geeignete RNAs (gRNAs) kann das genom an jeder gewünschten Stelle geschnitten werden |
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Struktur eines CRISPR-Cas Locus? |
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Welches ist das meist genutzte CRISPR-Cas System? |
Typ II |
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Was ist das PAM Motiv? |
= protospacer adjacent motif - Ziel Sequenz Spezifität ist vermittelt durch 20 Nukleotid Space Region in der crRNA, welche komplementär zur Ziel DNA und einem 2 Nukleotid Motiv (NGG, N=A,C,G,T) ist -> Zielort der DNA wird geschnitten |
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Funktionsweise des CRISPR-Cas Systems? |
- CAs9 Protein bindet an crRNA und formt RIbonukleoprotein störenden Komplex. crRNA Sequenz leitet Komplex zu einer komplementären Sequenz in der Ziel-DNA. An crRNA Sequenz befindet sich eine Ziel-DNA bindende Sequenz (crRNA Spacer). crRNA Spacer ist variabler Adapter -> bindet Ziel DNA Sequenz. DNA wird nahe der Bindungsstelle geschnitten |
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2 Typen von RNA, die Funktion der RNA Interferenz (RNAi) haben? |
1. Micro RNA (miRNA) - einzelsträngig gefaltet 2. small interfering RNA (siRNA), trans-acting siRNA (tasiRNA) - lang doppelstränig |
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Wo kommen siRNAs und miRNAs her? |
- siRNA: exogene und endogene RNAs, ursprünglich aus Virus, Transgenen oder Transposons - miRNA: nur endogen transkribierte mRNA von nicht Protein kodierenden Genen |
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2 RNAi basierte Silencing Pathways? |
1 TGS (transkriptional gene silencing) - DNA methylation - Heterochomatin Formation 2 PTGS (post transcriptional gene silencing) - message cleavage - inhibition der Translation |
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Welche pathways können siRNAs benutzen? |
PTGS durch mRNA cleavage und TGS Funktion durch induzierte DNA Methylierung im Nukleus |
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Beispiele von natürlichen Funktionen der siRNA? |
- Transposon silencing in Arabidopsis Keimbahn -> verhindern Transposon Mobilisierung durch DNA-Methylierung - vermitteln die Reparatur von DNA DSBs -> benötigt dazu RNA Pol IV, RNA-abhängige RNA Pol und Dicker like Proteine - vermitteln Regulation der Genexpression (Bsp. Salzstress) - Funktion der Degradation von anomalen Transkription -> bspw. wenn 3' Poly(A) oder 5' Cap fehlt |
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Beispiele von natürlichen Funktionen der miRNA? |
- Regulieren Normales Pflanzenwachstum |
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Was sind mögliche Anwendungen der RNA Interferenz? |
- RNAi Technologie ermöglicht erstellen von Custom Knockdown Pflanzen
- Erlaubt das Silencing eines spezifischen Gens oder ganzer Genfamilien - eine Transformation kann unterschiedliche Pflanzen Linien mit unterschiedlichen Leveln des Silencing bringen - Weniger gesilencte Pflanzen erlauben das Überleben von Linien, für die ein Kompletter Verlust der Funktion letal wirken können |
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Was können Gründe für die Verwendung für Silencing von Tranigeren sein? |
- Multiple T-DNA (Agrobakterium schleust mehrere T-DNA ins Genom ein, mit Unterschiedlicher Orientation) - GFP silencing mit einer Antisense RNAi -> PTGS |
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siRNAs und Promoter? |
siRNAs können Promoter methylieren und somit Expression des gens verhindern (-> TGS) |
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was sind amiRNAs? |
Artificial miRNAs - können konstruiert werden um unterschiedliche endogene mRNAs zu reduzieren - können effizient einzelne oder multiple gene silencen - Ähnliche Effekte wenn sie unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoter expressiert werden |