Rening Av Nukleinsyror Och Proteiner

Front 1

Vad är viktiga saker att tänka på vid vävnadshantering?

Back 1

Skydda prover mot proteaser, ligaser och RNAser

Hålla vävnader på is för att minska enzymatisk nedbrytning

Hantera avfallet enligt rutiner

Labbrock, handskar och ev glasögon

Front 2

Vilka olika former av DNA kan extraheras?

Back 2

Total-cells DNA

Plasmid DNA

Fag DNA

Front 3

Vad styr vilken metod man använder sig av?

Back 3

Utgångsmaterial och nedströms applikation = kvar på ex. hur rent DNAt måste vara

Front 4

Vad gör RNA mindre stabilt än DNA?

Back 4

OH-bindningen i ribos

Front 5

Nämn de 5 stegen i DNA preparation

Back 5

1. Lysering av cellerna

2. Separation av det lösliga DNAt från cellrester och olösligt material

3. Bindning av DNA till reningsmatrix

4. Tvätta bort proteiner

5. Eluering av DNAt

Front 6

Med vilka olika metoder kan man lysera celler?

Back 6

Mekaniska metoder; hacka, frys-tina, krossa/mortla, sonikering, metall/keramiska kulor

Kemiska metoder: förstöra cellmembran och denaturera proteiner. Detegenter (ex. SDS) och ämnen (chaotropes) som förstör vätebindningar mellan molekyler

Enzymatiska metoder: enzymer som förstör vävnader och cellväggar, ex proteinase K

Front 7

Hur hanteras vävnad, celler i suspension och växtceller när dessa ska lyseras?

Back 7

Vävnad: homogeniseras mekaniskt genom att ex. hackas i bitar manuellt med skalpell, i kombination med mekanisk och/eller reagensbaserad metod

Celler i suspension: cellerna skördas (centrifugering) och odlingsmedium hälls av. Sen lyseras cellerna

Växtceller: celler lyseras med specifika detergenter och enzymer eller mekaniskt genom att mala/mortla

Efter lysering och centrifugering finns DNA/RNA och protein i suspensionsfasen (tas vidare)

Front 8

Vilka metoder används för att rena fram DNA?

Back 8

Högsalt extraktion: "salting-out"

Organisk extrakion: ex. fenol/kloroform

Jonbyteskromatografi: ex negativt laddat DNA/RNA binder till resin

DNA bindning: membran, silica (kiesel)-gel partiklar, magnetkulor

Front 9

Salt DNA extraktion, hur fungerar det?

Back 9

Högkoncentrerade saltlösningar (NaCl + proteinase K) fäller ut proteiner och cellmembranskräp centrifugeras bort. DNAt förblir lösligt

DNA fälls med isopropanol eller 99% etanol

DNA centrifugeras ner till pellet, supernatant kasseras

DNA pellet tvättas i 70% etanol, DNA pellet får torka, resuspenderas i nukleasfritt vatten eller buffer

Ett steg med RNAse behandling kan göras för att bryta ner ev RNA

Front 10

Hur fungerar organisk extraktion?

Back 10

Fenol-kloroform blandning tillsätts till cellsystem

Dessa fäller ut proteiner, medan DNA och RNA stannar i vattenlösning

Lagerna separeras mha centrifugering och vattenfasen (med DNA och RNA) tas upp

RNAse tillsätts

Front 11

Hur fungerar jonbyteskromatografi?

Back 11

DNA binder till det positivt laddade matrixet med resin

Jonbindningen löses upp genom att tillsätta salt-lösningar

Svag saltlösning först = gör att protein och RNA släpper och tvättas bort

Starkare saltlösning sedan = eluerar DNAt

DNAt fälls sedan och tvättas.

DNA pellet löses upp i nukleasfritt vatten eller buffer

Front 12

Hur fungerar DNA bindning till reningsmatrix?

Back 12

DNA binder starkt till silica-matrix (i närvaro av ett ämne som skyddar nukelinsyrorna i DNAt)

Sker i spin-kolumner

Det lyserade provets innehåll laddas på silica spinkolonn

DNAt binder silica, andra komponenter tvättas bort + RNAse tillsätts

DNA elueras genom att tillsätta elueringslösning som gör att DNAt släpper från silica-kolonnen

Front 13

Hur brukar en extraktion av plasmid-DNA ske?

Back 13

På liknande sätt, men andra kit och protokoll

Man vill skilja plasmid-DNAt från det bakteriella genomiska DNAt. Kan skiljas med avseende på ex. storlek och konformation

Front 14

Hur sker extrakion av Fag-DNA?

Back 14

Utgångmaterial: det extracellulära mediet från en fag-infekterad bakterieodling

Svårighet att få höga fag-titrar

Måste inducera bakterierna att gå in i lytisk fas

Specifika protokoll möjliggör rening av fag-DNAt

Front 15

Hur kan DNA analyseras?

Back 15

Med gelelektrofores; negativt DNA mot positiva polen

Förflyttning = molekylens form och förhållandet mellan laddning och massa

Front 16

Med vilka ämnen kan man stabilisera upp RNA?

Back 16

RNAlater

RNAprotect

RNAstable

Inhiberar RNAser

Front 17

Vilket RNA studeras främst?

Back 17

mRNA

Front 18

Hur genomförs en total RNA preparation?

Back 18

TRIZOL-baserad RNA extraktion:

TriZOL och kloroform tillsätts homogeniserat (likformigt) cellextrakt

Fas-separation, vattenfasen innehåller RNA

RNA fälls mha isopropanol + centrifugering och tvättas sedan med etanol (gör så att salter försvinner)

RNA pellet löses upp i nukleasfritt vatten

De andra faserna med DNA och protein kan tas om hand och dessa kan då också extraheras

Front 19

I vilket pH sker extraktion av DNA respektive RNA?

Back 19

DNA: pH 8 (alkaliskt)

RNA: 4,7 (surt), vid basiskt; hydrolys sker

Front 20

Preparation av små RNA

Back 20

Mha modifierade spin-kolonns protokoll

Kvantifieras mha bioanslyzer

Front 21

Vad är RIN (RNA integrity number?)

Back 21

Ett kvalitetsmått mellan 1-10 (10 bäst)

Front 22

Hur extraheras protein?

Back 22

Homogenisera celler eller vävnad i lyseringbuffer på is

Tillsätt lysbuffer (med skydd mot nedbrytning av proteaser, fosfataser)

Centrifugera bort cellrester

Kvantifiera protein

Front 23

Vad är svårigheterna med proteinextraktion?

Back 23

Välja en lyseringsbuffer som extraherar alla proteiner av intresse

Totala proteinmängden: albumin och gammaglobulin

Proteiner i kärnan mindre tillgängliga

Posttranslationella modifieringar ska studeras: behövs speciell lyseringsbuffer

Front 24

Vilka metoder kan användas för att mäta renhet och kvantitet?

Back 24

UV-spektrometri

Fluorescensinmärkning

Elektrofores

Electrophoresis on a chip

Front 25

+ och - med UV spektrofotometri

Back 25

Fördelar: låg provåtgång, snabb, blank är det enda som behövs, ger renhetsinformation (260/280, 260/230 ratio), ingen standardkurva behövs

Nackdelar: ej info om integritet, kan ge falskt höga koncentrationer (absorberar alla nukleinsyror i provet + DNA/RNA)

Front 26

Vad beskriver Beer Lamberts lag?

Back 26

Beskriver samband mellan absorbans, egenskaperna hos materialet som ljuset passerar genom och koncentration

Front 27

+ och - med fluorescensinmärkning

Back 27

Fördelar: låg provåtgång, hög sensitivitet, kräver ingen standradkurva, ger specifik info om dsDNA (ingen RNA signal), litet å smidigt instument

Nackdelar: ingen info om integritet, ger ej renhetsinfo, labbkrävande (kräver standard, spädning av prov, inkuberingstid innan mätning, mätning i rör eller platta)

Front 28

+ och - med elektrofores

Back 28

Fördelar: billigt, info om DNA integritet, kräver ingen standradkurva, bara storleksmarkör

Nackdelar: ingen info om konc. endast uppskattning om DNA mängd. Kräver stor provåtgång, ingen renhetsinfo, labbkrävande (gel, tar lång tid)

Front 29

+ och - med electrophoresis on a chip?

Back 29

Fördelar: liten provåtgång, info DNA integritet och konc, RIN, ger digital gel-liknande bild + diagram. Kan detektera korta nukelinsyror (ex. siRNA)

Nackdelar: dyrt, ingen renhetsinfo, labbkrävande (förberedelser av varje prov i rör/laddning på chip, inkubering på värme, tid ca 40 min för avläsning av ca 12 prover)

Front 30

Proteinkoncentration, hur bestäms den?

Back 30

Mha BCA protein assay

Standardkurva späds med BSA

Absorbans vid 562 nm från prover m okänd konc relaterad till std-kurva = bestämma proteinkoncentration