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48 Cards in this Set
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Td2 |
Culture cellulaire |
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Pourquoi faire des cultures |
Comprendre un processus physiologique Produire des molécules a usage diagnostique ou thérapeutiques |
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Types de cultures |
Primaires Secondaires Lignée cellulaire immortalisées Cellules souches |
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Cultures primaires |
Cellules isolées a partir de tissus ou d'organes ex Vivo Seulement quelques divisions |
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Cultures secondaires |
Cultures primaire +++ Quelques divisions en plus |
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Lignée immortalisée |
Immortelles Peuvent être transformées (ex : cancéreuses) Pas de limite de croissance |
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Cellules souches |
Indifférenciées, peuvent évoluer en n'importe quel type cellulaire spécialisé |
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Limite de hayflick |
Nombre de fois qu'une population de cellules normales de divise au maximum |
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Milieux de culture |
Milieu de base selon le type cellulaire Complètements Sérum (bovin ou cheval) |
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Milieu de base composé de |
Eau Source de C et d'énergie A.a. Sels minéraux Vitamines pH constant |
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Complètements sont |
Antibiotiques |
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Serum = |
Hormones Facteurs de croissance |
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Quels supports ? |
Plastique traité (agents oxydants,UV) revêtement de surface (collagène laminine) |
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Équipements |
Hotte a flux laminaire (stérilité et sécurité) Incubateurs Autoclave Congélateur a -80 ou container a azote liquide |
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Méthodes de quantification des cellules |
Comptage (hematimetre) Tests colorimétrique Bases marquées CFSE |
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Hematimetre |
Méthode directe Comptage de toutes les cellules sur cadre de Malassez mesure la croissance cellulaire |
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Tests colorimétrique |
MTT ou bleu de trypan Méthodes indirectes Comptage de cellules marquées (vivantes ou mortes selon test) |
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MTT |
Mesure la viabilité cellulaire via l'activité des deshygrogenases mitochondriales |
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Bleu de trypan |
Mesure la mort cellulaire car il ne se fixe que dans les cellules mortes, les vivantes le rejettent |
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Bases marquées |
Radioactivité (thymidine tritiée) ou immunomarquage (BrdU) Méthodes indirectes Activité mitogene Mesure de la réplication cellulaire |
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Marquage a la CFSE |
Cellule marquée est fluo, intensité diminue quand la cellule se divise donc 1 pic = une population de cellule divisée Méthodes indirectes Mesure de la prolifération |
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Mesurer l'expression des gènes a deux niveau |
Hybridation in situ pour l'ARNm Immunomarquage et protéine de fusion pour les protéines |
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Principe et Types d'Hybridation in situ |
Sonde marquée se colle a l'arnm d'intérêt Enzyme (visible au MO) Fluorochrome (MF) Billes d'or (ME) |
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Pour faire de la transfection il faut ... Et ça permet de ... |
Faire un plasmide Étudier la fonction d'un gène ou d'une protéine dans une cellule qui ne possède pas naturellement le gène |
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Étapes Essentielles |
Construire le plasmide Réplication du plasmide Introduire le plasmide Production/étude de la protéine |
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Carte plasmidique |
ADNc = adn complémentaire a l'arnm du brin voulu |
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Types de promoteurs |
Ubiquitaires Spécifiques d'un tissu Inductibles |
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Ubiquitaires |
S'exprime partout Ex : cmv d'origine virale; promoteurs de l'actine/tubiline |
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Inductibles |
Hormones dependant Inductibles au cuivre Avec des antibiotiques |
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Ex de promoteur inductible |
Tet-off : inhibe le facteur de transcription (mauvaise confirmation) Tet-on : active le facteur de transcription (bonne confirmation) |
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Entrée du gène d'intérêt par |
Transformation Transfection Transduction virale |
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Transformation |
Adn plasmidique dans une bactérie via chaleur et electropotation |
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Transfection |
Adn plasmidique dans une cellule eucaryote via techniques physique,chimique ou biologiques |
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Transduction virale |
Transfection grâce a un vecteur viral non replicatif |
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Méthodes physiques |
Microinjections directe dans le noyau Electroporation Bombardement de microprojectiles |
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Méthodes chimiques + principe |
Phosphate de calcium DEAE dextran Liposomes cationiques : lipofection Principe : surface cellulaire et adn sont chargées négativement, on va rentre l'ADN neutre pour qu'il puisse passer |
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Méthodes biologiques |
Vecteurs retroviraux |
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Microinjections |
Cellule par cellule Besoin de machine et de manipulateur |
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Electroporation |
Électricité va désordonné la membrane, plasmide rentre par les pores |
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Phosphate de calcium |
Adn + tampon phosphate + cacl2 => précipité de phosphate de calcium contenant adn |
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Deae dextran |
Longue chaîne chargée positif qui se complexe avec adn |
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Liposomes cationiques |
Lipides chargés positif contenant adn => neutre, peut passer la membrane |
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Vecteurs pour la transduction virale |
Vecteurs non intégratifs et integratifs |
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Non integratifs |
Virus a adn double brin (adeno pour les mammifères, baculo pour les insectes) |
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Integratifs |
Virus a arn (rétrovirus) Intégration dans le génome via transcription inverse |
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Rétrovirus avantages |
Expression stable Peut faire ça sur bcp de cellules Applicable in vivo |
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Rétrovirus désavantage |
Intégration aléatoire Réponse antivirale possible |
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Transfection peut être |
Transitoire ou stable |
