Immunkemiska Tekniker

Front 1

Immunkemi

Back 1

Olika tekniker som utnyttjar reaktioner mellan antikropp och antigen

Front 2

Ge exempel på 3 olika antigen

Back 2

Protein

Socker

Lipider

Front 3

Beskriv IgM

Back 3

Snabbt svar

Låg affinitet

Hög aviditet

Potential att binda ospecifikt

Front 4

Beskriv IgG (+IgA och IgE)

Back 4

Långsamt svar

Hög affinitet

Hög specificitet

T-cellsberoende

Front 5

Vad har immunoglobulin för funktioner?

Back 5

Skydd mot infektion

Metabola funktioner

Regulatoriska funktioner

Specificitet för främmande molekyler

Front 6

Vilken antikropp används främst till immunkemiska tekniker?

Back 6

IgG

Front 7

Beskriv IgG's variabla region

Back 7

Variabel region:

Antigenbindande

Hög affinitet

Hög specificitet

Varje AK binder unik epigon

AK kan utvecklas mot nästan vad som helst

Front 8

Beskriv IgG's konstanta region

Back 8

Bestämmer isotyp på AK

Fc-region = fragment crystalizable

- Fc-receptorbindning

-Komplementbindning

-Styr halveringstid (binder FcRn)

Front 9

Vad utnyttjar immunkemiska tekniker?

Back 9

Att antikroppar eller antikroppsliknande molekyler kan bildas mot antigen i många olika djurslag

Front 10

Hur kan AK bildas in vivo?

Back 10

Ett protein-antigen injiceras in i ex en mus, vilket gör att IgG antikroppar skapas mot det injicerade proteinet

Front 11

Polyklonala AK

Back 11

Antikroppar som har ursprung från många B/cellskloner

Efter vaccination: alla AK i cirkulation

Kan renas direkt från plasma

Bara en bråkdel specifika mot vaccinantigenet

Front 12

Monoklonala AK

Back 12

Har sitt ursprung från en enda specifik B-cellsklon

Alla är identiska

Alla är specifika mot samma epitop på vaccinantigenet

För framställning krävs ex affinitetsrening eller rekombinanta AK

Front 13

Hur fungerar affinitetsrening av AK?

Back 13

1. Beads binder till ag i en kolonn (består av en stationär fas och en mobil fas)

2. Polyklonalt anti-serum passerar genom kolonnen (mobila fasen). Endast AK fastnar (annat för litet = rinner igenom)

3. AK absorberas och blir immobiliserat genom en svag icke-kovalent bindning = endast de antigen-specifika AK fastnar

4. AK elueras och frigörs från liganden. Ex genom att pH ändras

Front 14

Vad är principen med att få fram rekombinanta AK?

Back 14

1. Isolera antigen-specifika B-celler

2. Sekvensera BCR

3. Skapa cellinje som producerar identiska antigen-specifika antikroppar

Front 15

Hur fungerar phage display?

Back 15

1. PCR-amplifiera antigen-bindande region från antikroppar

2. Tunga + lätta kedjan, inkorporeras i fags ytprotein

3. Fagen uttrycker fragment på ytan

4. Om fragmentet binder antigen = selektion

5. "Vinnande" fag isoleras, amplifierar DNA för antigenbindande region

6. Klona till expressionsvektor

7. Transformera cell och skapa cellinje som uttrycker AK med "vinnande" antigenbindande region

Front 16

Hur fungerar hybridomteknik?

Back 16

Två olika celler smälts ihop = hybridcell med nya egenskaper

1. Lymfocyt (kan producera AK) + myelomcell (goda delningsegenskaper, överlever i cellodling. Lättodlad)

2. Hybridcellerna med myelomcellernas tillväxtegenskaper + lymfocyternas AK producerande förmåga isoleras

3. Ur varje hybridomcell bildas en klon av celler, vilka alla producerar identiskt lika AK

Front 17

Hur fungerar singel cell cloning?

Back 17

1. Sorterar ut singel B-celler från en infekterad donators blod/plasma

2. Den tunga och lätta kedjan delas upp var för sig

3. Den tunga å lätta kedjan klonas

4. = monoklonala AK

Front 18

Hur fungerar nomenklaturen på AK?

Back 18

Art A = i vilken art genererades AK

Anti- art B protein X = ursprung och protein för det antigen som AK binder

Front 19

Fab och F(ab')2. När används de?

Back 19

Antigenbindande, men saknar Fc-del.

Används när Fc-receptorbindande region kan störa i metoder

Front 20

Vad klyver IgG för att få ett Fab-fragment?

Back 20

Papain

Front 21

Vad klyver IgG för att få ett F(ab')2 fragment?

Back 21

Pepsin

Front 22

Hur fungerar turbidimetri/nefelometri?

Back 22

Mäter absorbans (turbidimetri) och brytning av ljus (nefelometri)

Inducerar immunkomplexformation genom att tillsätta specifika antikroppar

Brytning eller absorbans av ljus = proteinkoncentrationen

Front 23

Agglutinationstest

Back 23

Vissa bakterier uttrycker protein som binder AK (som skydd mot dessa)

Ex S. aureus: uttrycker protein A som binder IgG

Front 24

Vad är coombs reagens? Hur framställs det?

Back 24

Coombs reagens = anti-human IgG

Genom att injicera humant IgG i djur, sedan isolera de resulterande polyklonala AK

Front 25

Beskriv direkt coombs test

Back 25

Tillsätter sekundära antikroppar (anti-human IgGk) till blod, som har primära antikroppar på sig

Front 26

Beskriv direkt coombs test

Back 26

Tillsätter sekundära antikroppar (anti-human IgGk) till blod, som har primära antikroppar på sig

Front 27

Vad används Coombs test till? Både direkta och indirekta

Back 27

Direkt: För att se om en person lider av anemi, ifall immunsystemet orsakar att rbcs förstörs

Indirekt: Klargöra ifall donerat blod kommer att accepteras av mottagarens immunsystem

Front 28

Beskriv direkt coombs test

Back 28

Tillsätter sekundära antikroppar (anti-human IgGk) till blod, som har primära antikroppar på sig

Front 29

Vad används Coombs test till? Både direkta och indirekta

Back 29

Direkt: För att se om en person har inkompletta IgG på ytan av RBCs, för att se om agglutinat bildas

Indirekt: Klargöra ifall donerat blod kommer att accepteras av mottagarens immunsystem

Front 30

Beskriv hur indirekt coombs test fungerar

Back 30

Tillsätter blod till primära AK, sedan sekundära AK och ser om det koagulerar

Front 31

Beskriv ELISA, hur det fungerar

Back 31

Utnyttjar antigen-specifika AK som är konjugerade till enzym

Mäter färgskift i lösning (ljusets våglängd)

Olika enzymreaktioner ger olika färgskift

Enzymreaktion (färgskift) är tidsberoende om reaktion inte stoppas

Front 32

Vad gör man om det inte finns någon standard? Hur hanterar man proverna då i en ELISA?

Back 32

Man titrerar proverna (både från friska och sjuka patienter) från varje individ och ställer upp en graf där

Y-axeln = absorbans

X-axeln = spädning

Ger en kurva som vid 50% ger en linjär ekvation

Man kan då jämföra med kända friska provers värde mot sjuka individers värde

Vid spädningar kommer brunnarna få olika djup i färgen

Front 33

Vad gör man om det inte finns någon standard? Hur hanterar man proverna då i en ELISA?

Back 33

Man titrerar proverna (både från friska och sjuka patienter) från varje individ och ställer upp en graf där

Y-axeln = absorbans

X-axeln = spädning

Ger en kurva som vid 50% ger en linjär ekvation

Man kan då jämföra med kända friska provers värde mot sjuka individers värde

Vid spädningar kommer brunnarna få olika djup i färgen

Front 34

Hur konstruerar du en standardkurva för mängd anti-protein X IgG i ELISA och hur kan du definiera vilken mängd av anti-protein X i IgG i plasma som indikerar att en patient lider av sjukdom X?

Back 34

Titrerar reagenserna så att man har en känd koncentration av IgG antikroppar mot X vid en viss absorbans.

Kan definieras genom att jämföra friska patienters mor sjuka patienters värden vid 50% (efter titrering)

Front 35

Ge exempel på 3 reportrar

Back 35

Beads

Enzym

Fluorokrom

Front 36

Agglutinationstest

Back 36

Utnyttjar att AK kan bilda eller bryta antigenkomplex

Hemagglutination = virus + röda blodkroppar = klumpar ihop sig

Agglutinationstest: virus med protein A + IgG AK med latex-kulor på = klumpar ihop sig

Vissa bakterier uttrycker protein som binder AK (som skydd mot dessa), ex S. Aureus = uttrycker protein A som binder IgG med hög affinitet

Front 37

Hur fungerar en direkt ELISA?

Back 37

1. Antigen (protein) fastsatta i botten av brunnarna i en speciell mikrotiterplatta

2. Tillsätter ett annat protein = blockerar oönskade inbindningsställen

3. Tillsätter en AK som är kopplad till ett enzym

4. AK binder till antigener

5. Sköljer brunnarna flera gånger = få bort överblivna AK

6. Tillsätter ett substrat som reagerar med enzymet på AK = färg i brunnen

7. Färgens styrka = hur mkt enzym i brunnen = mängden AK och antigen

8. Tillsätter stopplösning som stoppar färgreaktionen

Front 38

+ och - med direkt ELISA

Back 38

+ går snabbt att utföra, undviker korsreaktion med sekundär AK

- alla AK måste märkas in med enzymet = dyrt, alla AK passar ej för inmärkning

Front 39

Hur fungerar en indirekt ELISA?

Back 39

1. Antigen i botten på en brunn

2. Blockerar oönskade inbindningsställen

3. Tillsätter en primär AK, binder antigenet

4. Tillsätter en sekundär AK med ett enzym kopplat till sig

5. Den sekundära AK binder till den primära AK

6. Tvättar

7. Tillsätter substrat som reagerar med enzymet på den sekundära AK

8. Bildas en färg, tillsätter stopplösning

Front 40

+ och - med indirekt ELISA

Back 40

+ hög sensitivitet med de 2 AK som ska binda till samma antigen. Metoden är flexibel då man kan byta ut den primära AK mot andra AK

- risk för korsreaktioner mellan den primära och sekundära AK

Front 41

Hur fungerar en sandwich ELISA?

Back 41

1. AK i botten på en brunn

2. Tillsätter patientprovet (serum) finns ex. TSH (hormon) med ett antigen-site

3. Tillsätter en andra AK som är en anti-TSH antikropp = riktad mot TSH

4. Finns ett enzym på den andra AK

5. Tvättar

6. Tillsätter substratet TMB som reagerar med enzymet

7. Färgomslag = stopplösning, läses av i spektrofotometern

Front 42

Princip bakom Dot blot

Back 42

HCG-bindning till en anti-HCG antikropp

konjugat binder till en sekundär anti-HCG AK

Positiv kontroll (att urinen nått upp, fungerar testet som det ska?)

Grav. Test hittar hormonet HCG, med hjälp av monoklonala AK

En typ av antikroppar är bundna till ett färgämne och är placerade i den ena änden av en testremsa

Änden med färgämnet doppas i urin, finns HCG = binder till sig de färgade antikropparna

Urinen och AK sugs med urinen genom remsan med kapillärkraften

Urinen når en testlinje med en annan AK, som kan binda till sig en annan del av hormonet

Front 43

Hur fungerar ELISpot?

Back 43

Princip som sandwich ELISA

Kvantifierar antalet celler som producerar ett visst ämne

1. Cytokinspecifika AK är bundna till botten av en brunn

2. Aktiverade T-celler tillsätts, där T-cellerna har olika effektor-funktioner

3. Cytokin som producerats av några aktiverade T-celler fångas av de bundna AK i botten av brunnen

4. Det cytokin som AK bundit in kan hittas med hjälp av cytokinspecifika sekundära AK, som har ett enzym kopplat till sig. Detta färgas

Front 44

Princip WB?

Back 44

Princip = identifiera specifika protein från en komplex mix av protein från celler. Bestämma molekylvikt, upptäcka immunologisk-relaterade derivat av protein (ex. nedbrytningsprodukter)

Front 45

Hur fungerar WB?

Back 45

1. Rena fram proteininnehållet från celler/vävnad

2. Proteinerna separeras med SDS-Page, vilka separerar proteinerna med avseende på molekylmassa. SDS binder till peptidkedjan på proteinerna, samt gör de negativt laddade = proteinets storlek

3. Proteinerna får vandra i ett elektriskt fält genom en polyakrylamidgel, där de separerar

4. Proteinerna överförs till ett filter, mha elektrisk spänning

5. Membranet blockeras för att hindra ospecifik bindning av AK till membranets yta

6. Efter blockering, appliceras en specifik, primär AK på membranet, vilket binder proteinet av intresse

7. Sekundär AK appliceras, som binder den primära AK

8. Den sekundära AK är länkad till ett enzym, som omvandlar substratet till en detekterbar produkt

9. Färgomslag på membranet

10. Får inkubera mellan gångerna

Front 46

När och hur används fluorescenta AK

Back 46

För immunohistokemi och Flödescytometri

Används för att märka in celler för detektion, genom emission av specifika våglängder

Front 47

Vad är skillnaden på kvantitativa och kvalitativa värden?

Back 47

Kvantitativa: numeriska värden

Kvalitativa: ja eller nej

Front 48

Vad är preciptionsanalyser?

Back 48

Precipitationsanalys är när man fäller ut (precipiterar) protein eller antikroppar från en lösning - detta kan användas vid många tillfällen...

Front 49

Vad är isotypkontroll och unstained cells?

Back 49

unstained och isotypkontroll används för att se om celler har autoflourescens (unstained) eller om fluorokromen ger bakgrund även när du inte har specifik inbindning (iusotyp)

Front 50

Vad är emission spektrum?

Back 50

Emissonsspektrum är den/de våglängder som flourokromen avger efter excitation (dvs när elektronerna faller tillbaka och energi avges som ljus). Detta säger vilka filter och detektorer som ska finnas i flödescytometern)

Front 51

När använda turbidimetri och nefelometri?

Back 51

För att mäta förekomst av antikroppar och andra lösliga protein. T.ex. vid misstanke om defekt antikroppsproduktion.

M

Front 52

Rekombinant protein och rekombinent anti-human IgG

Back 52

rekombinant" visar att detta är ett protein eller en antikropp som produceras in vitro - dvs det är inte något som kommer direkt från en mus/människa/djur...utan något någon har klonat och nu producerar "artificiellt" i cellinje eller liknande.