Bakterie-Øvelser

Front 1

Hvilke primære test kan der laves?
(slægsbestemmelse)

Back 1

Gramfarvning

KOH

Motilitetsagar

Fasekontrasmikroskopi

VLFH

Cytochromoxidasetest

Katalaseprøve

O/F-test

NA vækst

MacConkey

Nitratmedium og nitrat reduktion

Front 2

Hvilke sekundære test kan der laves?

Front 3

Beskriv nigrosin-præparat
(kokker/stave)

Back 3

Hvordan?Afsæt en lille dråbe nigrosin på objektglas. Koloni påføres derpå og udrøres. Lufttørring

Hvad?Negativ farvning af bakterier. Alt hvad der ikke er bakterier farves med blæk.

Resultat?Farvestoffet trænger ikke ind i bakteriecellen, men danner en sort hinde mellem cellerne. Der kan herudfra bedømmes om det er kokker eller stave.

Front 4

Eksempel på nigrosin-præparat

Back 4

Front 5

Gramfarvning

Back 5

Hvordan? Objektglas dyppes i methylviolet 1 minut. Skylles med vand. Lugols opløsning 1 minut. Skylles med vand. 99% ethanol 20 sek. Skylles med vand. Safranin 30 sek. Skylles med vand og overskydende vand kan fjernes med filtrerpapir. Lufttørring.

Hvad?Binding af methylviolet til sure grupper i bakteriecellen, kan præcipitere i et kompleks med jod, som danner et sortblåd præcipitat. Dette lader sig udtrække med alkohol i G-, og farves blå i G+.

Resultat?G+: BlåG-: RødeKokker?Stave?Endosporer (ufarvet legeme i cellen)?

Front 6

Eksempel på gramfarvning

Back 6

Front 7

Kaliumhydroxidprøve (KOH)

Back 7

Hvordan?2 dråber 3% KOH på objektglas med afstand. Kolonimasse oprøres.

Hvad?Gramfarvbarhed ved slimdannelse.

Resultat?G+: mangel på slimdannelse (pga stor peptidoglycan lag i cellevæg)G-: slimdannelse (cellevæg nedbrydes og DNA frigives —> slimdannelse)

Front 8

Eksempel på KOH

Back 8

Front 9

Kulturel bevægelighedsprøve

Back 9

Hvordan?En flamberet podenal med kultur dyppes 1cm ned i halvflydende agar.

Hvad?Bakterie med eller uden flageller.

Resultat?Bevægelig: Frembringer en skyet uklarhed i glasset. Ubevægelig: Kun vækst i stikkanalen

Front 10

Bevægelighdesprøve mikroskopisk

Back 10

Hvordan?Kultur i flydende medium. Kultur anbringes på objektglas. Dækglas pålægges. Fasemikroskopi udføres nu.

Hvad?Kigger efter celler der bevæger sig i alle retninger. 1 retning løber de bare med agaren.

Resultat?Bevægelig: Ubevægelig:

Front 11

VL halvflydende medium (VLHF)
(Aerob og anaerob vækst)

Back 11

Hvordan?Med udrettet podenål podes kultur i rør med VLHF til bunds.

Hvad?Kan bakterien vokse med eller uden ilt.

Resultat? se billeder

Front 12

Back 12

Obligat aerobt: hvis bakterien kun kan vokse i overfloden

Anaerob vækst: Hvis bakterien kun kan vokse i bunden er den obligat anaerob

Front 13

Behov for ekstra CO2-test

Back 13

Hvordan?Hvis bakterien kan vokse på agarmedium i almindelig atmosfære har de ikke krav på ekstra CO2.

Hvad?Capnofile bakterier kræver 5-10% CO2.

Resultat?Ekstra CO2:

Front 14

Cytochromoxidaseprøve

Back 14

Hvordan?Oxidasereagens dryppes på filtrerpapirstrimmel. Podenål med kultur påsmøres. Aflæses efter 10 sek.

Hvad?Cytochrom C påvises.

Resultat?Positiv ved blå farve efter 10 sek

Front 15

Eksempel på cytochromoxidaseprøve

Back 15

Front 16

Katalaseprøve

Back 16

Hvordan?Kultur afsættes på objektglas. Dryppes med 3% H2O2. Aflæses for luftbobler.

Hvad?Har bakterien katalase og kan den derved spalte H2O2 til ilt og vand.

Resultat?Luftbobler: Katalase positiv
Ingen luftbobler: Katalase negativ.

Front 17

Eksempel på katalaseprøve

Back 17

Front 18

Oxidation/fermentation prøve

Back 18

Hvordan?Der podes til bund med kultur i O/F glukosemedium.

Hvad?Kan bakterien omsætte glukose fermentativt/oxidativt ved anaerobe og aerobe forhold.

Resultat?

Fermentativ reaktion: syredannelse (gulfarvning) både anaerobt og aerobt

Oxidativ reaktion: syredannelse i toppen pga. nedbrydning af glukose til glukonsyre

Glukosenegative: basisk omslag (evt. blåfarvning) som skyldes frigørelsen af ammoniak ved peptonomsætning. Omsætter altsåhverken glukose fermentativt/oxidativt.

Front 19

Eksempel på OF-prøve

Back 19

Front 20

Vækst på nutrient agar (NA)

Back 20

Hvordan?NA-agar inddeles i 2 felter. Stammerne podes i hvert felt 1 cm streg. Aflæses for vækst.

Hvad?Kan stammerne vokse på NA-agar.

Resultat?Vækst: Ikke vækst:

Front 21

Vækst på MacConkey agar

Back 21

Hvordan?MacConkey-agar inddeles i 2 felter. Stammerne podes i hvert felt 1 cm streg. Aflæses for vækst.

Hvad?Kan stammerne vokse på MacConkey-agar. Det er selektivt og indikativt medie der anvendes til påvisning af coliforme bakterier (der lever i tyktarmen) samt differentiering af Enterobacteriaceae

Resultat?Vækst: Ikke vækst:

Front 22

Eksempel på MacConkey agar

Selektivt princip: Natriumtaurokolat og krystalviolet virker inhibitivt på defleste Gram-positive bakterier. Enterobacteriaceae er galderesistente.

Indikativt princip: Natriumtaurokolat omdannes ved laktoseforgæring tiltaurokolsyre, der danner komplekser med neutralrødt. Neutralrødt erendvidere en indikator, som er rød ved en pH < 6,8 og gul ved en pH > 8,0.

Back 22

Front 23

Nitratreduktion

Back 23

Hvordan?Podes kultur i nitratmedium. Dagen efter tilsættes 1 ml Nit A reagens og 1 ml Nit B reagens (første trin). Ved ingen rødfarvning tilsættes zinkpulver og glasset observeres efter 10 min.

Hvad? Nitrat kan udnyttes af bakterier på 2 forskellige måder. Dels optager nogle bakterier et kvælstof fra nitratmolekylet som anvende i biosyntesen. Dels kan nogle bakterier anvende nitratmolekylets ilt ved en anaerob respiration.

Resultat?Rød farve første trin: Nitrit til stede
Ingen rødfarvning andet trin: Nitrat reduceret ud over nitriteller at nitrat ikke er reduceret

Front 24

Eksempel på nitratreduktion

Ved en nitratreduktionsprøve kan man påvise følgende 3 muligheder:

1. Ingen påviselig reduktion af nitrat.

2. Nitrat reduceres til nitrit, som ophobes.

3. Nitrat reduceres ud over nitrit. Ved dette tilfælde kan man evt. Vise, omslutproduktet er en luftart (læs: N2 eller N2O) ved at benytte et Durham-rør.

Back 24

Front 25

Hvilke sekundære test findes der?

Back 25

Koagulaseprøve

Mannitol saltagar

ONPG

Aeskulin-blodagar

Aeskulin-bouillon

Xylose-rhamnose bouillon

Durhamrør

Skråserum

Æggeblommeagar

Sulfitjernagar

Indol

MR/VP

Methylrødt prøve

Voges proskauer prøve

Simmons citrat

Ureasemedium

Ureaseenzymtest

Front 26

Koagulaseprøve

Back 26

Hvordan?Kultur podes i bouillon. Aflæses for koagulation efter 4 og 24 timer, da stafylokokker kan producere fibrinolysin som atter kan bringe det koagulerede plasma på flydende form.

Hvad?Stafylokokkers evne til at koagulere stabiliseret plasma.

Resultater?Koagulation:

Front 27

Eksempel på koagulaseprøve

Back 27

Front 28

Mannitol saltagar

Back 28

Hvordan?Der podes med kultur på agar.

Hvad?Selvektivt og indikativt medium for stafylokokker. Den høje saltkoncentration på 7,5% hæmmer mange andre bakterier.

Resultater?Vækst: Ikke vækst:

Front 29

Eksempel på mannitol saltagar

Selektivt princip: Den høje saltkoncentration på 7,5 % hæmmer de flestebakterier med undtagelse af Stafylokokker, der er saltresistente.

Indikativt princip: Staphylococcus aureus er mannitol-fermenterende.Under fermenteringen dannes syre, der medfører gult farveomslag af pH-indikatoren fenolrødt. Staphylococcus pseudintermedius ermannitolnegativ, dvs. Der forekommer intet farveomslag af fenolrødt.

Back 29

Front 30

ONPG

Back 30

Hvordan?Kultur overføres til rør med sterilt vand. Med steril pincet tilsættes ONPG-tablet.

Hvad?ONPG spaltes til en gulfarvet nitrophenol af enzymet beta-galactosidase (lactase), der dannes af Staphylococcus pseudintermedius men ikke dannes af Staphylococcus aureus.

Resultater?Har laktase: Staphylococcus pseudintermedius
Har ikke laktase: Staphylococcus aureus

Front 31

Eksempel på ONPG

Back 31

Front 32

Eskulin blodagar
(CAMP-test og bouillon)

Back 32

Hvordan?CAMP: Der podes med beta-toksisk Staphylococcus aureus som diameter. Vinkelret herpå stregpodes med kultur startende væk fra diameteren og ind mod den uden at berøre denne. Bouillon: Med udrettet podenål berøres kultur som derefter berører bouillonen.

Hvad?CAMP: Eskulin fluorescerer med blålig farve og eksulinhydrolise viser sig ved at manglende fluoroscens omkring kolonier. Desuden vil eskulinpositive kolonier vise en let brunfarvning fordi spaltningsproduktet eskulin er svagt brunfarvet. Bouillon: Ved positiv sortfarvning skyldes det udfældning af eskuletin med ferricitrat.

Resultater?Fluorescens: Sortfarvning:

Front 33

Eksempel på eskulin blodagar

Back 33

Aflæsning: Æskulin-blodagaren aflæses under UV-lys. En positiv test viser sigsom manglende fluorescering ved bakteriekolonierne, dvs. bakteriestammen harhydrolyseret æskulin til æskulitin.

Front 34

Eksempel på eskulin bouillon

Back 34

Aflæsning: Der aflæses for sortfarvning, som skyldes, at æskulitinudfældes med ferricitrat til et sort jernkompleks.

Front 35

Kulhydratmetabolisme (xylose- og rhamnosebouillon)

Back 35

Hvordan?Med podenål berøres kultur, som herefter berører bouillon.

Hvad?Bakteriel nedbrydning kan ske fermentativt eller oxidativt.

Fermentativt: syredannelse i både anaerobe og aerobe del af mediet

Oxidativ: syredannelse i den aerobe zone øverst i mediet.

Resultater?Fermentativ:Oxidativ:

Front 36

Eksempel på kulhydratmetabolisme

Back 36

Front 37

Skråserum (Loeffler serum)

Back 37

Hvordan?Kulturen berøres og føres til bunds i glasset uden at berøre mediet. På bunden berøres mediet og zig-zagges tilbage så mediets overflade podes. Der aflæses for proteolyse, der vil vise sig ved en udhuling af mediet under vækststregen.

Hvad?Undersøgelse af bakteriers proteolytiske egenskaber overfor serumproteiner.

Resultater?Proteolyse:

Front 38

Eksempel på skråserum

Back 38

Front 39

Æggeblommeagar

Back 39

Hvordan?Der podes en diameter på mediet.

Hvad?Påvisning af lecithinaseproduktion hos bla. Bacillus cereus, visse klostriumarter og Staphylococcus aureus.

Resultater? Vækst: Ikke vækst:

Front 40

Eksempel på æggeblommeagar

Indikative princip: Lecithinspaltende bakterier fraspalter fedtsyrer, derfremtræder som en hvid præcipitationszone omkring kolonierne.

Back 40

Front 41

Sulfitjernagar

Back 41

Hvordan?Med udrettet podenål podes ved stik til bunds.

Hvad?Sulfitreduktion forekommer hos Clostridium og hos Salmonella. Reduktion af sulfit til H2S, vil reagere med Fe+++ under dannelse af sort FeS, der udfælder.

Resultater?Udfældning:

Front 42

Eksempel på sulfitjernagar

Indikativt princip: Sulfit reduceres til H2S, som reagerer medtilstedeværende Fe+++, hvorved der dannes sort, uopløseligt FeS - dettefælder ud i og omkring de sulfitreducerende kolonier.

Back 42

Front 43

Indoltest

Back 43

Hvordan?Podes i kødvandspeptonbouillon, og tilsættes Kovacs indolreagens. Ved let omrystning ekstraheres indol i amylalkohollaget, der lejrer sig øverst i glasset og udvikler en rød farve. Ved negativ reaktion forbliver det gult.

Hvad?Aminosyren tryptofan kan fraspaltes alanin-sidekæden under dannelse af indol.

Resultater?Rød farve: Positivt - bakterien kan fraspalte tryptofanGul farve: Negativt

Front 44

Eksempel på Indol-test

Back 44

Front 45

Methylrødt & Voges Proskauer (MRVP)

Back 45

Hvordan? Podes med bakteriestamme og inkuberes

Hvad? Anvendes til bestemmelse af slut-pH i et glukose-fosfat-medium.

Resultater? Den udvoksede kultur tilsættes nogle dråber af pH-indikatoren methylrødt. Hvis substratets slut-pH < 5, fremkommerder en rød farve (læs: methylrødt-positiv), mens svageresyredannende bakterier viser en gul farve (læs: methylrødt-negativ).

Front 46

Eksempel på MRVP

Back 46

Front 47

Simmons citrat agar

Back 47

Hvordan?Zig-zag podning på overfladen.

Hvad? bestemmelse af evne til at udnyttet citrat som eneste kulstofkilde og ammoniumioner som eneste kvælstofkilde

Resultater? se billede

Front 48

Eksempel på simmons citrat agar

Back 48

Front 49

Luftproduktion - Dunhamrør (gas fra glucose)

Back 49

Hvordan?Opsamling af luft i minireagensglas (Durhamrør), anbragt med bunden opad i rør med glukosebouillon.

Hvad?Kan bakterien producere brint? CO2 opløses i vand.

Resultater?Luftproduktion:

Front 50

Eksempel på Dunham-rør

Back 50

Front 51

Urinstof bouillon

Back 51

Hvordan? Der podes to medier med kolonimasse. Et testmedie og etkontrolmedie. Disse inkuberes ved 37 °C og aflæses efter et døgn. Testmedietvil vise basisk omslag ved rødfarvning.

Hvad? Anvendes som særligt led i identifikation af proteus der er urease-positiv

Resultater? Ureaseproducerende bakterier vil i et urinstofholdigt medium spalte urinstoffettil CO2 og NH3, hvilket fremkalder en basisk reaktion, som kan vises vedrødfarvning af pH-indikatoren fenolrødt.

Front 52

Eksempel på urinstof-bouillon

Back 52

Kontrolmediet er lig testmediet, dog indeholder det ikke urinstof.Kontrolmediet vil vise en sur reaktion (læs: gul farve), hvis bakterien erglukosefermenterende og eller en neutral, rødgullig farve.

Front 53

Müller Hinton salt-polymyxin bouillon (MHSPB)

Back 53

Hvordan?Dag 1 —> Svaber fugtes i rør med sterilt isotonisk saltvand. Afsvabring af slimhinde i vestibulum nasi. Svaber deponeres i rør med MHSPB og den frie del afknækkes sådan at den kan være i røret. Inkubation 37 °C. Dag 2 —> Podning på blodagar med øjepodenål. Inkubation 37°C.

Hvad?Saltbouillon er selektivt for flydende opformering af Staphylococcus pseudintermedius og S. aureus. Polymoxin er selektivt for gram + bakterier.

Resultater? Ingen i gruppen havde Staphylococcus aureus. Kan kendes ved dobbelthæmolyse og gule kolonier.

Front 54

Macfarland, Muller Hinton agar & oxoid dispenser

Back 54

Hvordan?Gøres for begge kolonier —> Inocolum forberedes ved at overføre 5 kolonier til isotonisk saltvand. Her skal der opnås en uklarhed lig med MacFarland standard 0.5 (rør til sammenligning). Fugt en steril svaber i det netop lavede inokulum. Inokuler hele Müller Hinton agaren i 3 forskellige retninger for at sikre sammenflydende vækst. Sæt agar pladen ind under Oxoid disken og tryk på denne. Inkubation 37 °C. Der aflæses diameter størrelse for hver disk.

Hvad?Oxoid disks A og C indeholder hver især forskellige antibiotika. Der testes herefter for om bakterien er sensitiv eller resistent over for antibiotikaen. Se skema 9.

Resultater?se skemaer for resistensbestemmelse

Front 55

Resultater for resistensbestemmelse (G+)

Back 55

Front 56

Resultater for resistensbestemmelse (G-)

Back 56

Front 57

Bestemmelse af MIC-værdi ved agar fortynding

Back 57

Hvordan?Der bruges 3 Müller-Hinton agar plader med hver især 2, 10 og 40 μg/ml tetracyklin. På disse podes inokulum der tidligere er lavet ved at lave en enkelt streg med et loop i. Inkubation 37°C.

Hvad?MIC-værdien testes ved at teste bakteriens sensitivitet over for tetracyklin. Der hvor der skelner mellem vækst er MIC-værdien.

Resultater?MIC-værdi > 2 μg/ml tetracyklin da der sås en lille smule vækst på denne plade.

Front 58

Forklar fermentation

Back 58

Document1 Fermentation er en anaerob nedbrydningsproces, hvor glukose nedbrydestil pyrodruesyre. Pyrodruesyre kan nedbrydes videre til forskelligeslutprodukter. Fermentation er uafhængig af ilt.

Front 59

Forklar oxidation

Back 59

Oxidation er en aerob nedbrydningsproces, hvor glukosens aldehydgruppeoxideres til en carboxylgruppe. Dette resulterer i dannelsen af glukonsyre.Oxidation er afhængig af ilt.