• Shuffle
    Toggle On
    Toggle Off
  • Alphabetize
    Toggle On
    Toggle Off
  • Front First
    Toggle On
    Toggle Off
  • Both Sides
    Toggle On
    Toggle Off
  • Read
    Toggle On
    Toggle Off
Reading...
Front

Card Range To Study

through

image

Play button

image

Play button

image

Progress

1/48

Click to flip

Use LEFT and RIGHT arrow keys to navigate between flashcards;

Use UP and DOWN arrow keys to flip the card;

H to show hint;

A reads text to speech;

48 Cards in this Set

  • Front
  • Back
3.3 Metodik inom oral mikrobiologi

Varför vill man analysera den orala mikrofloran 2st
x klinik- underlättar vid diagnos och behandling

x forskning - undersöka normalfloran hos olika kategorier av patienter
Syften med forskning
undersöka normalfloran hos olika kategorier av patienter

x t.ex om vissa arter kan vara associerade till sjukdom.

x Eller om den orala mikrofloran kan korreleras till patientdata (ålder, livsstilsfaktorer, diet mm)
Varför är en del av munhålans bakterier inte odlingsbara 3st
x Odlingmedier i labbet saknar essentiella näringsämnen och/eller är toxiska för bakterier.

x Orala bakterier har co-evolverats som komplexa bakteriesamhällen (biofilmer) vissa av dom behöver andra bakterier för att kunna växa

x Pg av co-evulotionen har vissa gener deaktiverats (muterat) för biosyntes av vissa näringsämnen eftersom de förses med sånt i sin biofilm-miljö
Vad kan göra det svårt att analysera mikroflorans sammansättning? 6 saker.
- Hög artdiversitet , varav vissa i lågt antal
- Bindningen till ytor och varandra
- Vissa är obligata anaerober och tål inte syra (försvårar odling bla)
- Vissa är i allmänhet svåra att odla i labb.
- Vissa växer väldigt långsamt i labb.
- Oklarheter runt klassifikation
På vilka 3 sätt kan man analysera den orala mikroflorans sammansättning
x Direkt mikroskopi
x Odling
x Molekylärbiologisk metodik
Hur gör man provtagningar på saliv 3steg
1. Salivproduktion stimuleras genom att t.ex tugga på paraffin

2. Uppsamla saliv skickas för analys i tarnsportrör med buffert

3. För att anaeroba bakterier ska överleva sätts det i anaerobt, reducerande transportmedium
Varför gör man provtagningar på saliv? 3st
x Se koncentrationen av karies-associerade bakterier, oftast streptococcus mutans (s.mutans och s.sobrinus) och lactobacillus

x en övergripande bild av den orala mirkoflorans innehåll

x se vilka antikroppar det finns mot orala MO
Vad tar man subgingivala och supragingivala bakterierpov med
Subginvivala bakterieprov kan tas med steril kyrett eller sterila paper poitns. Supragingivala kan tas mes steril kyrett.
Hur gör man provtagningar på tandköttet
Subginvivala bakterieprov kan tas med steril kyrett eller sterila paper poitns. Supragingivala kan tas mes steril kyrett.

1. För en övergripande bild kan man välja 6 av de djupaste, mest inflammerade tandköttsfickorna med parodental nedbrytning.

2. bakterierpov sätts i ett anaerobt, reducerande transportmedium som innehåller syreindikator.

3. Bör odlas inom 2 dagar efter provtagning.
Vad får man ut av provtagningar på tandköttet
x Info om och i vilken utsträckning patienten är infekterad med parodontit-associerade bakteriearter vilket kan underlätta diagnostik och behandling

Annars är odlingsteknik det man använder sig mest av. Påvisa ofta förekomst av actinomycetemcomitans, prevotellabakterier osv.
Vilka bakterier kollar man efter vid provtagning från tandköttet 7st
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
porphyromonas gingivalis
prevotella intermedia/prevotella nigrescens
tannerekka forsythia
parvimonas micra
campylobacter rectus
spiroketer (svårodlade detekteras med mikroskopi)
Hur gör man provtagningar på slemhinnor
1. Topsa med steril bomullspinne över den slemhinnan eller sår som ska undersökas.

2. Pinnen förs över i transportrör med buffert (4ml)
Vad får man ut av att topsa slemhinnor
x I samband med vissa sjukdomar, behandlingar och medicineringar kan den orala slemhinnan infekteras av patogena MO eller sånt som annars inte förekommer på slemhinnan, provet görs för att påvisa förändringar
Vilka MO leter man efter när man tar prover från slemhinnan, 4
De MO man söker efter är ofta:
svamp (candida albicans)
enterokocker
enterobakterier
stafylokocker
hur gör man provtagningar på rotkanaler
1. Rotkanalen torkas ur med sterila paperpoint och fylls sedan med steril fysiologisk koksaltlösning

2. Kanalväggen skrapas ev med rotkanalsfil flr att få prov från dentinet.

3. Vätskan sugs upp med sterila paper point och överförs till transportröret.
Vad får man ut av provtagning av rotkanal
MO kan under vissa förhållanden kontaminera rotkanalen vilket gör det nödvändigt att eliminera dem därifrån

Prov säkerställer att rotkanalen är steril från t.ex enterokocker (främst) och prevotella, eubacterium, actinomycesarter, innan den rotfylls.
Vilka arter kollar man efter i prov från rotkanaler 4st
enterokocker (främst)
prevotella
eubacterium
actinomycesarter (vid tillstånd apikal parodontit kan dessa påvisas)
Varför använder man sig av direkt mikroskopi
x Det ger en övergripande bild av innehåll i provet utan att bearbetning av den krävs.
x man kan se motilitet och morfologi
Nackdelar med direkt mikroskopi
Ger ingen detaljerad bild av artsammansättningen.
vilka sorters mikroskopi finns det
Ljusmikroskopi - Morfologi och motilitet
konfokalmikroskopi - mikroskoperar även på djupet så att man med ett bildanalysprogram kan få en 3d struktur.
Proceduren för odlingsbaserad identifiering, hur man odlar dom på plattor dvs
Separera bakterieaggregaten i provet (t.ex vortex)

Seriespädning

Sprid på selektiva och/eller på icke selektiva odlingsmedium.

Inkubera plattorna på lämpligt sätt (temp, anarobt/aerobt, med CO2) upp till flera dagar

Sedan karaktäriserar man dom odlade bakterierna!
Metoder för karaktärisering av odlade bakterier, 4st
Direkt mikroskopi
Gramfärgning/kolonimorfologi
Identifiering mha biokemiska tester (katalas mm??)
Funktionella studier - studier av dess funktion
Hur gör man vid Anaerob bakterieodling
Man använder anaerobt, reducerande transportmedium.

Ett mindre antal odlingsplattor kan inkuberas i en anaerobkruka.
Många odlingsplattor sätts in ett en anaerobkammare.
Icke selektivt odlingsmedium
Odlingsmedium som tillåter växt av maximalt antal bakterier. t.ex blodagarplatta. Olika sorters bakterier.
Selektivt medium
Tillåter bara tillväxt av ett begränsat antal arter, så att det man letar efter t.ex inte blir överväxt av mer snabbväxande bakterier.

Ej klar alla olika selektiva medium..
Hur gör man för att kunna odla ut så många bakteriearter som möjligt från ett kliniskt prov, t.ex tandköttsficka eller saliv? 4st
x ta prov så att även anaeroba överlever,aerrobt reducerande transportmedium.

x odla ut provet så snabbt som möjligt, senast inom 2 dagar

x odla på både rikt och olika typer av selektivt medium

x odla plattorna både anaerobt och aerobt, och aerobt med CO2. (Plattorna måste också inkuberas på lämpligt sätt: temperatur, anaerobt/aerobt, med CO2 ??, samma sak odla/inkubera?)
Vad används Molekylärbiologiska metoder till
Används för att identifiera orala bakteriearter i kliniska prover

Baseras ofta på analys av makromolekyler som finns i alla bakterier, metoden är odlings-oberoende
Vad kollar man på med molekylärbiologiska metoder 2st
Man kollar på:
x nukleinsyra (DNA och RNA) vanligast
x proteiner

(??)
Molekylärbiologiska metoder från ett utodlat prov
PCR (polymerase chain reaction) med artspecifika primers för att testa om en viss arts DNA finns i kolonin (man måste veta vad man kollar efetr)

Man kan även använda universal primers så får man alla arter med PCR- Därefter bestämma DNA-sekvensen och söka i databaser så att man på så sätt hittar arten.
Molekylärbiologiska metoder från kliniska prov
DNA kan extraheras direkt från kliniska prov t.ex plack, gingivalvätska etc, så man kan hoppa odlingssteget.

Köra PCR direkt på DNA, då kan man även hitta icke odlingsbara bakterier.

Finns även kvantitativa PCR (real-tids PCR) som kan användas för att bestämma mängden av en viss art i förhållande till totalmängden i ett prov.
Molekylärbiologiska metoder innefattar vilka metoder
PCR

främst på kliniska prover men även på odlade prover. universalprimers för alla artern eller artspecifika.
PCR direkt på DNA -
Kvantitativ PCR -

Indirekt ELISA, sandwich ELISA (ej gjord)
Indirekt ELISA
ej gjord!!
Funktionella studier. Orala MO som går att odla i labb kan studeras med avseende på
hur de växer
hur de påverkar värden
virulensfaktorer/toxiner/enzymer
hur de interagerar/binder till andra bakterier/värden
antibiotikaresistens
hur de tål bakteriehämmande medel etc etc
Flödescell
"reaktorkammare" som används för att kunna kontinuerligt följa tillväxt av t.ex orala bakteriearter i biofilm-

Biofilmen matas kontinuerligt med näring till flödescellen och den kan studeras direkt i mikroskopet utan att biofilmen störs eller skadas
In situ modeller
Kan bäras i munnen på frivilliga och utgöra modellytor för kolonisation av MO. Sedan tas dessa loss och analyseras, t.ex med avseende på bakterieflorans sammansättning.
Exempel då in situ modeller kan användas 3st
studera plackbildning på löstagbara bitar emalj eller annat material som monterats på tänder.

sätta utanpå tanden en fyllning eller krona med artificiella sprickor och sedan studera plackutvecklingen.

Kan studera effekt av sockerintag eller nya bakteriehmmande medel etc. svårt att göra detta på naturliga tänder utanför munnen.
Studier av bakterie-värd interaktion, ej gjord!
smsns
Studiefrågor
hur fungerara metoden och hur kan man använda den i t.ex klinik och forskning
för och nackdelar med odlingsbaserade metoder, direkt mikroskopi och molekylärbiologiska metoder?
ex. vilken provtagningsmetod och odlingsprocedur kan man använda för att underlätta diagnos vid parodontit, karies eller rotkanalinfektion?
hur kan man ta reda på vilken art(er) man odlat fram, och vilka arter kan vara relevanta?
hur kan man studera icke odlingsbara bakterier
hur kan man ta reda på sammansättningen av den orala mikrobiotan hos en patient
vilka Funktionella studier finns det
Flödescell
In situ modeller
Studier av bakterie-värd interaktion
vad gör man med PCR
Man använder PCN på en uppodlad bakterie för att kopiera dess DNA och göra analyser på det.

Det går också att använda universala-primers så alla arter DNA-sekvens kan bestämmas. Därefter kan DNA sekvensen sökas i databas och på så vis går det att veta arten.

Det går också att extrahera DNA direkt från ett prov utan att odla upp det först. Exempelvis från plack eller gingivalvätska.

Om PCR körs direkt på DNA går det också att hitta icke odlingsbara arter. Det finns även kvantitativ PCR som kan mäta av förhållandet mellan mängden av en viss bakterie och totalmängden bakterier.
5.5 Molekylärbiologiska metoder för artbestämning och typning inom oral mikrobiologi

Viktiga generella metoder
PCR
DNA-sekvensering
Hybridisering
PCR
Polymerase chain reaction.
Metod för att amplifiera "kopiera" DNA
Hur går PCR till, ej gjord
Denatuering
Annealing
Extension
Vad kan man göra med PCR-produkten (amplikonet)
x Köra den på agarosgel för att påvisa att genen man letade efter finns i DNAt -T.ex testa om en viss bakterieart finns i ett prov. PCR-produkten syns då som ett distinkt band. Utan PCR-amplifiering ser man inget på gelen.

x Bestämma produktens DNA-sekvens och köra den mot en databas
Kvantitativ realtids-PCR (qPCR)
PCR metod där man kan se hur mkt PCR-produkt det blir under själva körningen. Vanlig PCR ger bara en grov uppskattning.
När använder man DNA-sekvensering
När man vill bestämma den exakta DNA-sekvensen.

Vad krävs för att utföra DNA-sekvenstering
Vad är Pyrosekvensering
Pyrosekvenseing är en metod där DNA binder till en kula och placeras i små brunnar. Där frigörs energi som omvandlas till ljus och på så vis går det att se om nukleotiderna är A,C,G eller T.
Hybridisering
Baseras på spontan homolog basparning mellan två enkelsträngade nukelinsyror (DNA, RNA) förutsäter hög sekvenslikhet

Ena DNA-strängen märks in med exempelvi fluorescens. Man ser då ifall basparning skett för då börjar det lysa.